Name: Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie ein Aptamer-basierter Fluoreszenzsensor ungechelatiertes Gadolinium(III) in wässrigen Lösungen mit hoher Selektivität und submikromolarer Empfindlichkeit detektiert. Diese Methode verbessert die Sicherheit von MRT-Kontrastmitteln.

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Wir möchten Dr. Milan N Stojanovic von der Columbia University, New York, NY für wertvollen wissenschaftlichen Input danken. Diese Arbeit wird von der California State University East Bay (CSUEB) und dem CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher unterstützt. O.E., T.C. und A.L. wurden durch das CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship unterstützt.

HINWEIS: die Molekularbiologie Wasser wird in allen Puffer und Lösungs-Präparate eingesetzt. Alle Einweg-Röhrchen (Mikro und PCR) und Pipettenspitzen sind DNase- und RNase-frei. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für alle Chemikalien vor der Verwendung. Einsatz einer persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wird dringend empfohlen. 1. Herstellung der Stammlösungen Aptamer <ol><li> kommerziell Kauf 2 Stränge von Polydesoxynukleotid-. Um beide Stränge mit Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Strand 1 (Gd-Aptamer): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; Strand 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Man löst jeder Strang in Wasser auf 100 &amp; mgr; M einzelnen Stammlösungen des Gd-Aptamer und dem QS machen. </li><li> Bewahren Sie diese Lösungen bei -20 ° C. Die Lösungen sind stabil bisher, für 3 Jahre. </li><li> Zur Minimierung der freeze-Auftau-Zyklen, speichern Sie die Stammlösungen in 10 &amp; mgr; l-Aliquots. </li></ol> 2. Herstellung des 2x Gd-Sensorlösung <ol><li> Vorbereitung der Testpuffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Stellen Sie den pH-Wert auf ~ 7,4 mit NaOH und HCl, und filtriert durch sterile Einwegflasche Top-Filter mit 0,2 um PES-Membran. Lagern Sie in sterile Flaschen. Wenn filtriert und richtig gespeichert (bei Raumtemperatur), ist der Puffer bisher stabil, für 2 Jahre. </li><li> Verdünnen Sie 1 ul des Gd-Aptamer-Stammlösung (aus Schritt 1.2) und 2 ul der QS-Stammlösung (aus Schritt 1.2) in 497 &amp; mgr; l Testpuffer. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Ihre Konzentrationen in der 2x Gd-Sensorlösung werden 200 nM und 400 nM. HINWEIS: Das Volumen des 2x Gd-Sensorlösung in diesem Schritt hergestellt wird , ist 500 &amp; mgr; L, der 6 zu testen ausreicht - 7 verschiedene Konzentrationen von Gd 3+ für die Kalibrierungskurve und der Kontrastmittel - Lösungen(Schritt 3). Jede Probe geben Dublikatmulden in einer 384-Well-Platte. <ol><li> Stellen Sie die Lautstärke des 2x Gd-Sensorlösung entsprechend der Anzahl von Gd 3+ Lösungen , die getestet werden muss. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die 2x Gd-Sensorlösung in 9 PCR-Röhrchen, mit 50 &amp; mgr; l in jedes Röhrchen. Die Röhrchen in einen Thermocycler. </li><li> Stellen Sie das Programm in den Thermocycler die Lösung in den Rohren bis 95 ° C zu erhitzen, Halten für 5 min und dann langsam abkühlen, die Lösungen auf 25 ° C über ca. 15 min (mit einer Rate von ~ 0,05-0,1 ° C / s). Die Heiz- und Kühlkreislauf ist eine optimale Hybridisierung zwischen dem Gd-Aptamer und dem QS zu gewährleisten. Teilhybridisierungsergebnisse in unvollständigem Abschrecken und eine höhere Hintergrundfluoreszenz des Sensors. Wenn ein Thermocycler nicht verfügbar ist, führen Sie diesen Prozess stattdessen ein heißes Wasserbad. </li><li> Nach dem Abkühlen auf 25 ° C, verwenden Sie sofort die Lösung, oder halten Sie in den Thermocycler (bis ca. 2 h), bis sie bereit zu seinbenutzt. Wenn ein Wasserbad für die Heizung verwendet wird, lassen Sie die Rohre im Bad, da das Wasser kühlt langsam auf Raumtemperatur. </li></ol> 3. Konstruieren der Fluoreszenz - Kalibrierungskurve und Nachweis der Anwesenheit von unchelatisierte Gd 3+ in einer Lösung von Gd Kontrastmittel <ol><li> Man löst GdCl 3 Feststoff in dem Testpuffer (den gleichen Puffer , wie in Schritt 2.1). </li><li> Durch Reihenverdünnung, Herstellung von 100 &amp; mgr; l von jeweils 6 verschiedenen Gd 3+ Lösungen in Mikrozentrifugenröhrchen bei Doppel der endgültigen gewünschten Konzentrationen für die Eichkurve (2x Lösungen). <ol><li> Um zum Beispiel eine Kalibrierung für 0 (nur Puffer ohne GdCl 3) zu konstruieren, 50, 100, 200, 400 und 800 nM von Gd 3+, werden die Lösungen , die 0, 100, 200, 400, 800 und 1600 nM des Ions. Achten Sie darauf, immer auch die &#39;blank&#39; mit 0 nM Gd 3+ als negative Kontrolle. </li></ol></li><li> Man löst das Kontrastmittel-Test zu seinin dem Assaypuffer ed. Bereiten 2 oder 3 verschiedenen Konzentrationen der Kontrastmittel-Lösungen über serielle Verdünnung. HINWEIS: Test 3 verschiedenen Konzentrationen des Kontrastmittellösung empfohlen. Damit soll sichergestellt werden, dass diese Konzentrationen im linearen Bereich liegen. Wenn die getesteten Proben keine lineare Beziehung anzuzeigen, verwendet, um die Konzentrationen des Kontrastmittels verringern. </li><li> Nehmen Sie die PCR-Röhrchen, die 2x Gd-Sensor-Lösung aus Schritt 2.5 aus dem Thermocycler enthält. </li><li> In 50 ul jeder Gd 3+ Lösung aus Schritt 3.2 in 6 der 9 PCR - Röhrchen , die 2x Gd-Sensorlösung enthält. Mischen durch Pipettieren von oben und unten. Jedes PCR - Röhrchen enthält nun die gewünschte Konzentration von Gd 3+ getestet werden, 100 nM Gd-Aptamer und 200 nM QS. </li><li> Zu der verbleibenden PCR-Röhrchen die 2x Gd-Sensorlösung enthält, werden 50 ul der Kontrastmittel-Lösungen aus Schritt 3.3. Gut mischen durch Pipettieren nach oben und unten ein paar Mal. </li><li> Inkubieren Sie die solutions in den PCR-Röhrchen ca. 5 min bei Raumtemperatur. Sie können bis zu 30 Minuten stehen gelassen werden. </li><li> Übertragen Sie 45 ul jeder Röhre in eine 384-Well-Platte. Jedes PCR-Röhrchen geben Dublikatmulden. </li><li> Notieren Sie sich die Fluoreszenz von jeder Vertiefung auf einem Plattenleser. Das Fluorophor (FAM), die in dem Gd-Sensor-Design hat Anregungs- und Emissionsmaxima von 495 und 520 nm sind, wie auf der Website des Herstellers aufgeführt. Wählen geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen oder Filter abhängig davon, ob der Plattenleser ist monochromator- oder Filterbasis. </li><li> Zeichnen Sie die graphische Darstellung der Fluoreszenz in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) gegen die Konzentration von Gd 3+. </li><li> Zeichnen Sie die Grafik als Fluoreszenz - fache Veränderung gegen die Konzentration von Gd 3+. Berechnen Sie die Fluoreszenz - fache Veränderung durch das AFU jeder Konzentration durch das AFU des &#39;leeren&#39; Lösung Teilen (mit 0 nM von Gd 3+). Die Fluoreszenz-fache Änderung wird für die n erlaubenormalization der Ergebnisse sollte die AFU Display einige periodische (verschiedene Tage, etc.) Variationen. </li><li> Vergleichen der Fluoreszenzemission der Lösung des Kontrastmittels und die &quot;leere&quot; enthalten, die die Lösung ist , die 0 nM GdCl 3 (nur Puffer). HINWEIS: Eine höhere Fluoreszenz der GBCA Lösung impliziert die Anwesenheit von unchelatisierten Gd 3+, die weitere Reinigung des Kontrastmittels erforderlich machen kann. Die Menge an unchelatisierte Gd 3+ vorhanden kann in Schritt 3.10 oder 3.11 konstruiert unter Verwendung der Eichkurve abgeschätzt werden. </li></ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Verwendung der Aptamer-basierten Gd-Sensor, ein Anstieg in der Fluoreszenzemission , die auf die Konzentration des unchelatisierten Gd 3+ proportional ist beobachtet wird . Um die Menge der Probe zu minimieren verwendet wird, kann der Test in einem 384-Well-Mikroplatten mit einer Gesamtprobenvolumen von 45 &amp; mgr; l pro Vertiefung ausgeführt werden. In dieser Konstruktion ist die Wahl von Fluorescein (FAM) und DABCYL (Dab) wurde auf die Kosten der Reagenzien basieren in erster Linie; die Emissionswellenlän...

Die zunehmende Bedeutung der Kernspintomographie (MRI) in der klinischen Diagnose, die durch die inhärente Empfindlichkeit der Technik begrenzt ist, hat in dem schnellen Wachstum der Forschung in die Entwicklung von neuartigen Gadolinium-Kontrastmitteln (GBCAs) 1 geführt. GBCAs sind Moleküle , die verabreicht werden , um die Bildqualität zu verbessern, und sie haben typischerweise die chemische Struktur eines dreiwertigen Gadolinium - Ion (Gd 3+) zu einem mehrzähnigen Liganden koordiniert. Diese Komplexbildung ist von entscheidender Bedeutung , da unchelatisierten Gd 3+ ist giftig; es wurde bereits 2 in der Entwicklung von nephrogener systemische Fibrose bei einigen Patienten mit Nierenerkrankung oder Versagen gebracht. Folglich wird die wäßrige freie Ionen Erfassungs dazu bei, die Sicherheit der GBCAs gewährleisten. Die Anwesenheit von unchelatisierten Gd 3+ in GBCA Lösungen ist oft das Ergebnis einer unvollständigen Reaktion zwischen dem Liganden und dem Ion, Dissoziation des Komplexes oder displacement durch andere biologische Metallkationen 3. Unter den verschiedenen Techniken , die derzeit zur Bestimmung der Anwesenheit von Gd 3+, diejenigen , die sich auf Chromatographie und / oder Spektrometrie Rang höchsten in Bezug auf Vielseitigkeit und Anwendbarkeit 4. Unter ihren Stärken sind eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, die Fähigkeit , verschiedene Matrices (einschließlich humanem Serum 5, Urin und Haar 6, Abwasser 7 und Kontrastmittelformulierungen 8) und die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Gd 3+ Komplexe (eine Auflistung zu analysieren vor dem Jahr 2013 von Studien in einer umfassenden Überprüfung von Telgmann et al.) 4. Der einzige Nachteil ist , dass mehrere dieser Verfahren erfordern Instrumentierungen (wie induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie) 4 , dass einige Laboratorien haben möglicherweise keinen Zugriff auf. Im Rahmen der neuen GBCA Entdeckung an der Forschung und Proof-of-Concept-Ebenen, arelatively bequemer, schneller und kostengünstiger spektroskopischen-basierte Verfahren (wie UV-Vis-Absorption oder Fluoreszenz) kann als eine wertvolle Alternative dienen. Mit diesen Anwendungen im Blick, ein fluoreszierendes Aptamer-basierten Sensor für wässrige Gd 3+ wurde 9 entwickelt. Das Aptamer (Gd-Aptamer) ist ein 44-Basen langen einzelsträngigen DNA - Moleküls mit einer bestimmten Sequenz von Basen , die durch den Prozess der systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) 9 isoliert. Um das Aptamer in einen Fluoreszenzsensor anzupassen, ein Fluorophor an das 5&#39; - Ende des Stranges befestigt sind , die dann mit einem Quenching Strang (QS) über 13 komplementären Basen (Abbildung 1) hybridisiert ist. Der QS ist mit einem dunklen Quencher-Molekül am 3&#39;-Terminus markiert. In der Abwesenheit von Gd 3+, dem Sensor (Gd-Sensor), einer 1 umfasste: 2 - Molverhältnis von Gd-Aptamer und QS bzw. haben, minimale Fluoreszenzemission aufgrund to Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem Quencher. Die Zugabe von wässrigem Gd 3+ das QS vom Gd-Aptamer, was zu einem Anstieg in der Fluoreszenzemission verdrängen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> Abbildung 1. Der Sensor (Gd-Sensor), der mit Fluorescein (ein Fluorophor) und dem langen Lösch Strang (QS) getaggt mit Dabcyl (ein dunkler Löscher) 13-Basis (Gd-Aptamer) markiert 44-base lange Aptamer besteht . In Abwesenheit von unchelatisierten Gd 3+, die Fluoreszenz des Sensors ist minimal. Mit Zugabe von Gd 3+, Verschiebung des QS auftritt und eine Erhöhung der Fluoreszenzemission beobachtet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Es ist derzeit, eine häufig verwendete spektroskopische basiertes Verfahren zur Erkennunging wässrigen Gd 3+. Dieser Assay verwendet das Molekül Xylenolorange, die 433 bis 573 nm auf Chelatisierung an die Ionen 10 eine Verschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge unterzogen wird . Das Verhältnis dieser zwei Absorptionsmaxima können verwendet werden , um die Menge des unchelatisierten Gd 3+ zu quantifizieren. Das Aptamer Sensor ist eine Alternative (kann auch komplementär sein) an den Xylenolorange-Test, als die beiden Verfahren unterschiedliche Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise pH und der Zusammensetzung der Pufferlösungen verwendet wird) haben, Ziel Selektivitäten, linearen Bereichen der Quantifizierung und Erfassungsmodalitäten 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-Aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Eingangssequenz und Fluorophormodifikation in der Ordnungsform</td><td>Es kann ein Fluorophor mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet werden. Das Aptamer kann auch bei einem anderen Unternehmen bestellt werden.</td></tr><tr><td>Abschreckstrang</td><td>IDTDNA</td><td>Inputsequenz und Quenchermodifikation in der Ordnungsform</td><td>Es kann ein anderer Quencher für einen optimalen Energietransfer aus dem Fluorophor verwendet werden. Das Aptamer kann auch bei einem anderen Unternehmen bestellt werden.</td></tr><tr>Wasser <td></td><td></td><td>in molekularbiologischer Qualität</td><td>Kein bestimmter Hersteller, sowohl DEPC- als auch nicht DEPC-behandelte Produkte funktionieren gleich gut</td></tr><tr><td>Gadolinium(III)-chlorid wasserfreies</td><td>Strem</td><td>936416</td><td></td></tr><tr><td>Toxisches HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid wasserfrei</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>327300025</tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, Pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td>Korrosive</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Giftige und korrosive</td></tr><tr><td>384-Well-Platten aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden und niedrigem Flansch</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Platten, die für Fluoreszenz geeignet sind Lektüre sind erforderlich.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow steriler Einweg-Flaschenaufsatzfilter</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>Der Flaschendeckel ist mit einer 0,2-Mikron-PES-Membran ausgestattet</td></tr><tr><td>Sterile Einwegflaschen 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>Es kann eine größere oder kleinere Flasche verwendet werden</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td>Kein bestimmter Hersteller, solange es sich um DNAse- und RNAse-freie</td></tr><tr><td>0,2 mL PCR-Röhrchen</td><td></td><td></td> <td>handeltKein bestimmter Hersteller, solange es sich um DNAse und RNAse-freie</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td></td><td></td> handelt <td>Kein bestimmter Hersteller</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (ohne Filter) in entsprechenden Größen</td><td></td><td></td><td>Kein bestimmter Hersteller, solange sie DNAse und RNAse-frei sind</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Plattenleser anderer Hersteller würden genauso gut funktionieren</td></tr></tbody></table>

ein aptamer-basierten sensor für unchelatisierte gadolinium (iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von unchelatierten dreiwertigen Gadolinium-Ionen (Gd3+) in wässriger Lösung wird demonstriert. Gd3+ ist häufig in Proben von gadoliniumbasierten Kontrastmitteln als Ergebnis unvollständiger Reaktionen zwischen dem Liganden und dem Ion oder als Dissoziationsprodukt vorhanden. Da das Ion giftig ist, ist sein Nachweis von entscheidender Bedeutung. Darin werden der Aufbau und die Verwendung eines Aptamer-basierten Sensors (Gd-Sensor) für Gd3+ beschrieben. Der Sensor erzeugt eine Fluoreszenzänderung als Reaktion auf steigende Konzentrationen des Ions und hat eine Nachweisgrenze im nanomolaren Bereich (~100 nM mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3). Der Assay kann in einem wässrigen Puffer bei einem Umgebungs-pH-Wert (~7 - 7,4) in einer 384-Well-Mikroplatte durchgeführt werden. Der Sensor reagiert relativ unempfindlich auf andere physiologisch relevante Metallionen wie Natrium-, Kalium- und Calciumionen, obwohl er nicht spezifisch für Gd3+ gegenüber anderen dreiwertigen Lanthanoiden wie Europium(III) und Terbium(III) ist. Dennoch sind die Lanthanide in Kontrastmitteln oder den biologischen Systemen nicht häufig zu finden, so dass der Sensor zur selektiven Bestimmung von unchelatiertem Gd3+ unter wässrigen Bedingungen verwendet werden kann.

Eine typische Fluoreszenzänderung des Gd-Sensorlösung in Gegenwart von unchelatisierten Gd 3+ ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Emission kann als die Fluoreszenz - fache Veränderung (2A) oder die rohe Fluoreszenzablesen (2B) in willkürlichen Einheiten aufgetragen werden (AFU). Beide Diagramme ergeben sehr ähnliche Eichkurven mit einem linearen Bereich für die Konzentration von Gd 3+ unter 1 &amp; mgr; M und der Sä...

Die Verwendung von Polydesoxynukleotid-Molekülen (44-mer-Aptamer) zur Erfassung von unchelatierten Gadolinium(III)-Ionen in einer wässrigen Lösung wird beschrieben. Das Vorhandensein des Ions wird über eine Erhöhung der Fluoreszenzemission des Sensors detektiert.

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Das übergeordnete Ziel dieses fluoreszenzbasierten Assays besteht darin, das Vorhandensein toxischer, ungechelater Gadoliniumionen in wässrigen Lösungen nachzuweisen, die Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie enthalten. Diese Methode kann die Entwicklung gadoliniumbasierter MRT-Kontrastmittel unterstützen, indem sie eine Möglichkeit bietet, eine hohe Reinheit der synthetisierten Wirkstoffe sicherzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie in der Lage ist, unkchelierte toxische Gadoliniumionen im Submikromolarbereich mit relativ hoher Selektivität gegenüber anderen biologischen Metallkationen nachzuweisen.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Assay-Puffer gemäß der schriftlichen Anleitung vorbereiten. Stellen Sie mithilfe von Natriumhydroxid und Salzsäure den pH-Wert auf 7,4 ein. Anschließend filtrieren Sie den Puffer durch einen sterilen, weggeworfenen Flaschentopf-Filter mit einer 0,2-Mikron-PES-Membran.Überführen Sie anschließend 497 Mikroliter des Assaypuffers in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie ein Mikroliter der hergestellten Gadolinium-Aptamer-Stammlösung und zwei Mikroliter der hergestellten QS-Stammlösung hinzu. Überführen Sie jeweils 50 Mikroliter dieser 2X-Gadolinium-Sensorlösung in neun PCR-Röhrchen.Stellen Sie die Röhrchen danach in einen Thermocycler. Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass die Proben fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzt und anschließend innerhalb von 15 Minuten langsam auf 25 Grad Celsius abgekühlt werden. Es ist wichtig, daran zu denken, die 2X-Gadolinium-Sensorlösungen auf 95 Grad Celsius zu erhitzen und dann langsam auf Raumtemperatur abzukühlen, bevor die Gadolinium-Ionen-Lösung hinzugefügt wird.Zunächst wird festes Gadoliniumtrichlorid im Assaypuffer gelöst, um eine Stammlösung von Gadolinium drei mit der gewünschten Konzentration herzustellen. Anschließend werden durch serielle Verdünnung sechs Lösungen von je 100 Mikroliter Gadolinium drei gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet. Danach wird das zu prüfende Kontrastmittel im Assaypuffer gelöst.Verwenden Sie eine serielle Verdünnung, um drei verschiedene Konzentrationen herzustellen. Entfernen Sie anschließend die PCR-Röhrchen mit der 2X-Gadolinium-Sensorlösung aus dem Thermocycler. Übertragen Sie 50 Mikroliter jeder der drei Gadolinium-Lösungen in separate PCR-Röhrchen.Pipettieren Sie jede Lösung mehrmals auf und ab, um sie zu mischen. Übertragen Sie anschließend jeweils 50 Mikroliter jeder Kontrastmittel-Lösung separat in die verbleibenden PCR-Röhrchen. Mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Alle neun Lösungen fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach jeweils 45 Mikroliter jeder Lösung im Duplikat in eine 384-Well-Platte übertragen. Anschließend Fluoreszenzdaten aufzeichnen und wie im Textprotokoll beschrieben analysieren.In dieser Studie wird das nicht-chelatierte dreiwertige Gadoliniumion in wässriger Lösung mithilfe eines fluoreszenzbasierten Verfahrens nachgewiesen. Der fluoreszierende Sensor wird hergestellt, indem ein Fluorophor an den Aptamer gebunden wird. Der Sensor wird anschließend mit einem Quenchstrang hybridisiert, der mit einem dunklen Quencher-Molekül markiert ist.Die Zugabe von Gadolinium drei verdrängt die Quenching-Sequenz von dem Aptamer und führt zu einer Zunahme der Fluoreszenzemission. Kalibrierungskurven werden unter Verwendung von 100 Nanomolar Gadolinium-Aptamer und 200 Nanomolar QS erhalten und entweder als rohe Fluoreszenz oder als Fluoreszenz-Faltungsänderung aufgetragen. Beide Kurven zeigen einen linearen Bereich für Gadolinium-drei-Konzentrationen unterhalb von einem Mikromolar sowie eine Signalverstärkung bei Konzentrationen über drei Mikromolar.Es werden dann zwei verschiedene Chargen von Gadotetraat auf Konzentrationen im Bereich von null Millimolar bis 20 Millimolar analysiert. Während die Fluoreszenzemission der hochreinen Probe über diesen Bereich hinweg kaum zunimmt, wird bei der Probe, die nicht chelisiertes Gadolinium(III) enthält, bereits bei Konzentrationen von nur fünf Millimolar eine signifikante Änderung beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen der Mikroplatte befinden, da diese die Fluoreszenzmessung verfälschen würden.Mithilfe dieses Verfahrens könnten wir selbst geringe Mengen berechneter Gadoliniumionen in Lösungen nachweisen, die Kontrastmittel enthalten. Dies wird eine geeignete Methode zur Bestimmung der Reinheit der Mittel darstellen. Das Arbeiten mit Chemikalien kann gefährlich sein, und es ist wichtig, Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung zu beachten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Wir zeigen die Metallierung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoid-Komplexen. Die hier beschriebenen Komplexe können konjugiert werden, um Makromoleküle, damit diese Rückverfolgung Moleküle mittels Magnetresonanztomographie.

Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Um MR Krebs molekulare Bildgebung mit einem kleinen Peptid gezielte MRT-Kontrastmittel spezifischen geronnen Plasmaproteine ​​in Tumorstroma in einem Mausmodell zeigen, Prostata-Krebs.

MR Molekulare Bildgebung von Prostatakrebs mit einem kleinen Molecular Targeted CLT1 Peptid-Kontrastmittel

Es wird ein Protokoll zur Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele bereitgestellt, basierend auf einer einstellbaren Methode zur Auswahl magnetischer Beads. Aptamere, die mit strukturwechselnden Eigenschaften ausgewählt wurden, sind vorteilhaft für Assays, die eine Konformationsänderung erfordern, um das Vorhandensein eines Ziels zu signalisieren, wie z. B. der beschriebene Goldnanopartikel-Assay.

Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von biofunktionalisierten preußischblauen Nanopartikeln und ihre Verwendung als multimodale, molekulare Bildgebungsmittel. Die Nanopartikel haben ein Kern-Schale-Design, bei dem Gadolinium- oder Mangan-Ionen im Nanopartikelkern einen MRT-Kontrast erzeugen. Die biofunktionale Hülle enthält Fluorophore für die Fluoreszenzbildgebung und Targeting-Liganden für das molekulare Targeting.

Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Der Entwurf und die Entwicklung eines Aptamers-Gold-Nanoteilchen kolorimetrischen Assay für den Nachweis kleiner Moleküle für in-the-Feldanwendungen untersucht. Zusätzlich wird ein Smart-Gerät farbmetrische Anwendung (App) wurde validiert und langfristige Lagerung des Tests wurde für den Einsatz auf dem Gebiet etabliert.

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

Ein Verfahren zur Isolierung von EOB-DTPA und anschließende Komplexierung mit natürlichen Ga (III) und 68 Ga hier präsentiert wird, sowie eine gründliche Analyse aller Verbindungen und Untersuchungen zur Kennzeichnung Effizienz, In - vitro - Stabilität und der n- Octanol / Wasser Verteilungskoeffizient des radiomarkierten Komplexes.

Untersuchungen über die Ga (III) -Komplexes von EOB-DTPA and Its<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radiolabeled Analog

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung eines dendrimeren Magnetresonanztomographie (MRI), die Kontrastmittel trägt cyclen basierenden makrocyclischen Chelate paramagnetischen Ionen Gadolinium- koordinieren. In einer Reihe von MRI - Experimente in vitro produzierte dieses Mittel ein verstärktes MRI - Signal , wenn an dem handelsüblichen monomeren Analogon verglichen.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung der für Magnetresonanz-Kontrastmittel Dendrimer-basierten

Ein Protokoll für die in-vitro- Selektion und Charakterisierung von gruppenspezifischen Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA Aptameren wird vorgestellt. Die Anwendung von der ausgewählten Aptamer in einem elektrochemischen Aptasensor ist ebenfalls enthalten.

Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor

Hier präsentieren wir ein Protokoll erhalten68Ga Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikel über schnell Mikrowelle-driven Synthese. Die Methodik macht PET / (T1) MRI Nanopartikel mit enzymatische Effizienz höher als 90 % und 99 % in einer 20-min-Synthese radiochemische Reinheit.

Synthese von 68-Ga-Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikeln für Dual Positronen-Emissions-Tomographie / (T1) Magnetic Resonance Imaging

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Assay, der schnell und kostengünstig die Fähigkeit neuartiger Verbindungen bestätigen kann, Eisen zu chelatisieren. Der Assay misst die Fähigkeit von Verbindungen, die Eisenbindungsaktivität der schwachen Eisenchelat-Fluoreszenzsonde Calcein zu übertreffen, was zu einem quantifizierbaren Anstieg der Fluoreszenz führt, wenn eine Chelatbildung auftritt.

Quantifizierbare und kostengünstige zellfreie Fluoreszenzmethode zur Bestätigung der Fähigkeit neuartiger Verbindungen, Eisen zu chelatisieren 

Erfahren Sie, wie ein Aptamer-basierter Fluoreszenzsensor ungechelatiertes Gadolinium(III) in wässrigen Lösungen mit hoher Selektivität und submikromolarer Empfindlichkeit detektiert. Diese Methode verbessert die Sicherheit von MRT-Kontrastmitteln.

Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

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