Ein Aptamer-basierten Sensor für unchelatisierte Gadolinium (III)

Das übergeordnete Ziel dieses fluoreszenzbasierten Assays ist der Nachweis des Vorhandenseins von toxischen unchelatierten Gadolinium-Ionen in wässrigen Lösungen, die Magnetresonanztomographie-Kontrastmittel enthalten. Dieses Verfahren kann dazu beitragen, die Gadolinium-basierten MRT-Kontrastmittel zu erleichtern, indem es ein Mittel bereitstellt, um eine hohe Parität der synthetisierten Wirkstoffe zu gewährleisten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in der Lage ist, die submikromolare Konzentration von uncheliertem toxischem Gadolinium mit einer relativ hohen Selektivität gegenüber anderen biologischen Metallkationen nachzuweisen.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie den Assay-Puffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie mit Natriumhydroxid und Salzsäure den pH-Wert auf 7,4 ein. Filtrieren Sie dann den Puffer durch einen sterilen Einweg-Flaschenaufsatzfilter mit einer 0,2-Mikron-PES-Membran.

Übertragen Sie anschließend 497 Mikroliter des Assay-Puffers in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie einen Mikroliter vorbereitete Gadolinium-Aptamer-Stammlösung und zwei Mikroliter vorbereitete QS-Stammlösung hinzu. Übertragen Sie 50 Mikroliter dieser 2X Gadolinium-Sensorlösung in jedes der neun PCR-Röhrchen.

Legen Sie danach die Rohre in einen Thermocycler. Stellen Sie den Thermocycler so ein, dass er die Proben fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzt, und kühlen Sie die Lösungen dann langsam über 15 Minuten auf 25 Grad Celsius ab. Es ist wichtig, daran zu denken, die 2X-Gadolinium-Sensorlösungen auf 95 Grad zu erhitzen, gefolgt von einem langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur, bevor die Gadolinium-Ionenlösung hinzugefügt wird.

Lösen Sie zunächst festes Gadoliniumtrichlorid in einem Assay-Puffer auf, um eine Gadolinium-Stammlösung mit der gewünschten Konzentration herzustellen. Bereiten Sie unter Verwendung der seriellen Verdünnung sechs 100-Mikroliter-Gadolinium mit drei Lösungen her, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach lösen Sie das zu testende Kontrastmittel in Assay-Puffer auf.

Verwenden Sie die serielle Verdünnung, um drei verschiedene Konzentrationen herzustellen. Entfernen Sie dann die PCR-Röhrchen mit der 2X-Gadolinium-Sensorlösung aus dem Thermocycler. Übertragen Sie 50 Mikroliter jeder Gadolinium-Drei-Lösung in separate PCR-Röhrchen.

Pipettieren Sie jede Lösung mehrmals auf und ab, um sie zu mischen. Übertragen Sie anschließend 50 Mikroliter jeder Kontrastmittellösung separat auf die restlichen PCR-Röhrchen. Mischen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.

Inkubieren Sie alle neun Lösungen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie danach 45 Mikroliter jeder Lösung in Duplikaten auf eine 384-Well-Platte. Zeichnen Sie dann die Fluoreszenzdaten auf und analysieren Sie sie, wie im Textprotokoll beschrieben.

In dieser Studie wird ein unchelatiertes dreiwertiges Gadolinium-Ion in wässriger Lösung mit einer fluoreszenzbasierten Methode nachgewiesen. Der Fluoreszenzsensor wird entwickelt, indem ein Fluorophor an das Aptamer angehängt wird. Der Sensor wird dann mit einem Quenchstrang hybridisiert, der mit einem dunklen Quenchermolekül markiert ist.

Die Zugabe von Gadolinium drei verdrängt den Quenchstrang aus dem Aptamer, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzemission führt. Kalibrierkurven werden unter Verwendung von 100 nanomolaren Gadolinium-Aptamern und 200 nanomolaren QS erstellt und entweder die Rohfluoreszenz oder die Fluoreszenzfaltungsänderung aufgetragen. Beide Kurven zeigen einen linearen Bereich für Gadolinium, drei Konzentrationen unter einem Mikromolar und die Sättigung des Signals bei Konzentrationen über drei Mikromolaren.

Anschließend werden zwei verschiedene Chargen von Gadoteriansäure auf Konzentrationen von null Millimolar bis 20 Millimolar analysiert. Während die Fluoreszenzemission der hochreinen Probe in diesem Bereich nicht merklich zunimmt, wird eine signifikante Veränderung in der Probe beobachtet, die uncheliertes Gadolinium drei bei Konzentrationen von nur fünf Millimolar enthält. Bei diesem Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen der Mikroplatte befinden, da dies den Fluoreszenzwert verändert.

Mit diesem Verfahren können wir möglicherweise auch kleine Mengen berechneter Gadolinium-Ionen in kontrastmittelhaltigen Lösungen nachweisen. Dies ist eine gute Methode, um die Reinheit der Mittel zu bestimmen. Die Arbeit mit Chemikalien kann gefährlich sein, und es ist wichtig, bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung