Name: Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Aprenda a detectar íons de gadolínio não quelatados tóxicos usando ensaio baseado em fluorescência com aptâmeros. Este método oferece alta sensibilidade e seletividade para garantir a segurança de agentes de contraste de ressonância magnética.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Milan N Stojanovic da Columbia University, New York, NY por valiosas contribuições científicas. Este trabalho é apoiado por financiamento da California State University East Bay (CSUEB) e do CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C. e A.L. foram apoiados pela bolsa de estudos do CSUEB Center for Student Research (CSR).

NOTA: água de qualidade para biologia molecular é utilizado em todas as preparações de amortecimento e de solução. Todos os tubos descartáveis ​​(microcentrífuga e PCR) e pontas de pipeta são DNase e RNase. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) para todos os produtos químicos antes da utilização. Uso de equipamento de proteção individual (EPI) é fortemente recomendado. 1. Preparação de Soluções de Stock aptâmero <ol><li> Comprar 2 fios de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas as cadeias com purificação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Vertente 1 (Gd-aptâmero): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; Strand 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li> Dissolver cada vertente na água para fazer 100 mm soluções stock individuais do Gd-aptâmero e o QS. </li><li> Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C. As soluções são estáveis ​​até agora, durante 3 anos. </li><li> Para minimizar Freezciclos e-descongelamento, armazenar as soluções de estoque em 10 mL alíquotas. </li></ol> 2. Preparação da Solução 2x Gd-Sensor <ol><li> Prepara-se o tampão de ensaio (HEPES 20 mM, MgCl 2 2 mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajustar o pH para ~ 7,4 com NaOH e HCl, e filtrar através de filtros para frascos estéreis descartáveis ​​com 0,2 m de membrana PES. Armazenar em garrafas estéreis. Se filtrada e armazenada correctamente (à temperatura ambiente), o tampão é estável até agora, durante 2 anos. </li><li> Dilui-se 1 mL da solução de estoque de Gd-aptâmero (a partir do passo 1.2) e 2 uL da solução de estoque QS (a partir do passo 1.2) em 497 uL de tampão de ensaio. Misturar bem utilizando um vortex. Suas concentrações na solução de Gd-sensor de 2x são 200 nm e 400 nm, respectivamente. NOTA: O volume da solução de Gd-sensor de 2x preparado neste passo é de 500 mL, o que é suficiente para testar 6 - 7 concentrações variáveis de Gd3 + para a curva de calibração e as soluções de agente de contraste(passo 3). Cada amostra irá dar poços duplicados de uma placa de 384 poços. <ol><li> Ajustar o volume da solução de Gd-sensor de 2x de acordo com o número de soluções Gd 3+, que necessita de ser testado. </li></ol></li><li> Transferir a solução de Gd-sensor de 2x em 9 tubos de PCR, com 50 uL a cada tubo. Colocar os tubos num ciclizador térmico. </li><li> Definir o programa no termociclador para aquecer a solução nos tubos a 95 ° C, mantida durante 5 min, e em seguida arrefecer lentamente a solução até 25 ° C ao longo de ~ 15 min (a uma taxa de ~ 0,05-0,1 ° C / s). O ciclo de aquecimento e arrefecimento é assegurar a hibridação óptima entre o Gd-aptâmero e QS. resultados parciais de hibridação em têmpera incompleta e um fundo mais elevado de fluorescência do sensor. Se um termociclador não está disponível, realizar este processo utilizando um banho de água quente em vez disso. </li><li> Uma vez arrefecida a 25 ° C, utilizar imediatamente a solução, ou manter-se no termociclador (até cerca de 2 h) até que esteja pronto para serusava. Quando um banho de água é utilizado para o aquecimento, deixam os tubos no banho como a água arrefece-se lentamente até à temperatura ambiente. </li></ol> 3. a obtenção da curva de calibração de fluorescência e detectar a presença de não quelatada Gd3 + em solução de Gd agente de contraste <ol><li> Dissolve-se 3 GdCl sólido no tampão de ensaio (o mesmo tampão como no passo 2.1). </li><li> Através da diluição em série, preparar 100 mL cada um de 6 soluções de Gd 3+ diferentes em tubos de microcentrífuga com o dobro das concentrações finais desejadas para a curva de calibração (2x soluções). <ol><li> Por exemplo, para construir uma calibração para 0 (apenas tampão sem GdCl 3), 50, 100, 200, 400, e 800 nM de Gd3 +, preparar soluções contendo 0, 100, 200, 400, 800 e 1600 nM do ião. Certifique-se sempre incluir o &quot;vazio&quot; com 0 nM Gd 3+ como controle negativo. </li></ol></li><li> Dissolve-se o agente de contraste a ser testeed no tampão de ensaio. Preparar 2 ou 3 diferentes concentrações das soluções de agente de contraste, por diluição em série. Nota: Os testes 3 diferentes concentrações da solução de agente de contraste é recomendado. Isto é para assegurar que estas concentrações estão dentro do intervalo linear. Se as amostras testadas não exibem uma relação linear, reduzir as concentrações do agente de contraste utilizado. </li><li> Tome os tubos de PCR contendo a solução 2x Gd-Sensor do passo 2.5 do termociclador. </li><li> Adicionar 50 mL de cada solução Gd 3 + a partir do passo 3.2 em 6 dos tubos de PCR 9 contendo a solução 2x Gd-sensor. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Cada tubo de PCR agora contém a concentração desejada de Gd3 + a ser testado, com 100 nM de Gd-aptâmero e QS 200 nm. </li><li> Para os restantes tubos de PCR contendo a solução de Gd-sensor de 2x, adicionar 50 uL das soluções de agente de contraste a partir do passo 3.3. Misture bem, pipetando para cima e para baixo algumas vezes. </li><li> Incubar as solutions nos tubos de PCR de cerca de 5 min a temperatura ambiente. Eles podem ser deixados em repouso durante até 30 min. </li><li> Transferir 45 uL de cada tubo numa placa de 384 poços. Cada tubo de PCR dará poços duplicados. </li><li> Gravar a fluorescência de cada poço num leitor de placas. O fluoróforo (FAM) usada no projeto Gd-sensor tem excitação e emissão máximos de 495 e 520 nm, respectivamente, conforme listado no site do fornecedor. Escolha comprimentos de onda ou filtros de excitação e emissão adequados, dependendo se o leitor de placas é monochromator- ou baseado em filtro. </li><li> Traçar o gráfico da fluorescência em unidades de fluorescência arbitrárias (AFU) contra concentração de Gd 3 +. </li><li> Traçar o gráfico como a mudança de fluorescência vezes contra a concentração de Gd 3 +. Calcule a variação de fluorescência vezes dividindo o AFU de cada concentração pela AFU da solução &quot;vazio&quot; (com 0 nM de D&#39;us 3+). A alteração de fluorescência de dobragem vai permitir a Normalization dos resultados, caso a exibição AFU alguns periódica (dias diferentes, etc.) variações. </li><li> Comparar a emissão de fluorescência da solução que contém o agente de contraste e o &quot;branco&quot;, que é a solução contendo 0 nM GdCl 3 (tampão apenas). NOTA: A maior fluorescência da solução GBCA implica a presença de não quelatada Gd3 +, o que pode necessitar de purificação adicional do agente de contraste. A quantidade de não quelatada Gd 3+ presente pode ser estimada utilizando a curva de calibração construída na etapa 3.10 ou 3.11. </li></ol>

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<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Usando o Gd-sensor baseado em aptâmero, um aumento na emissão de fluorescência que é proporcional à concentração de não quelatada Gd3 + é observada. Para minimizar a quantidade de amostra utilizada, o ensaio pode ser executado numa microplaca de 384 cavidades com um volume total de amostra de 45 uL por poço. Neste design, a escolha de fluoresceína (FAM) e dabcil (DAB) baseou-se principalmente sobre o custo dos reagentes; para modificar o comprimento de onda de emissão, um emparelhamento diferente de fluorófor...

A importância crescente das imagens de ressonância magnética (MRI) em diagnóstico clínico, que é limitada pela sensibilidade inerente da técnica, resultou no rápido crescimento de investigação para o desenvolvimento de novos agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs 1). GBCAs são moléculas que são administrados para melhorar a qualidade da imagem, e eles tipicamente têm a estrutura química de um ião trivalente gadolínio (Gd 3+) coordenado a um ligando polidentado. Esta complexação é de importância crítica como D&#39;us não quelatada 3+ é tóxico; tem sido implicado no desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica, em alguns pacientes com doença renal ou falha 2. Consequentemente, a detecção do íon livre aquosa é fundamental para garantir a segurança dos GBCAs. A presença de não quelatada Gd3 + em soluções GBCA é muitas vezes o resultado de uma reacção incompleta entre o ligando e o ião, a dissociação do complexo, ou displacement por outros cátions metálicos biológicos 3. Entre as várias técnicas usadas atualmente para determinar a presença de D&#39;us 3+, aqueles que dependem de cromatografia e / ou classificação espectrometria mais alto em termos de versatilidade e aplicabilidade 4. Entre as suas vantagens são de alta sensibilidade e precisão, a capacidade de analisar diferentes matrizes de amostras de soro humano (incluindo 5, urina e cabelo 6, 7 de águas residuais, e formulações de agentes de contraste 8), e a quantificação simultânea de múltiplos complexos Gd 3+ (um perfil de estudos antes de 2013 é descrito em uma revisão abrangente por Telgmann et al.) 4. O único inconveniente é que vários destes métodos requerem instrumentação (tais como espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado) 4 que alguns laboratórios não podem ter acesso. Dentro do contexto da nova descoberta GBCA na investigação e níveis prova-de-conceito, ARmétodo baseado em espectroscopia elatively mais conveniente, rápido e de baixo custo (por exemplo, absorção de UV-Vis ou de fluorescência) pode servir como uma alternativa valiosa. Com esses aplicativos em mente, um sensor baseado em aptâmero fluorescente para aquosa Gd3 + foi desenvolvido 9. O aptâmero (Gd-aptâmero) é uma molécula de ADN de 44 bases de comprimento de cadeia simples com uma sequência específica de bases que foi isolado por meio do processo de evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial (SELEX) 9. Para adaptar o aptâmero em um sensor fluorescente, um fluoróforo está ligado ao terminal 5 &#39;da cadeia, que é então hibridado com uma cadeia de têmpera (QS), através de 13 bases complementares (Figura 1). O QS é marcado com uma molécula quencher escuro no terminal 3 &#39;. Na ausência de Gd3 +, o sensor (Gd-sensor), composta de uma mistura 1: 2 proporção molar de Gd-aptâmero e QS respectivamente, terá de emissão de fluorescência mínima devido tO transferência de energia do fluoroforo para o inibidor. A adição de solução aquosa Gd3 + irá deslocar o QS do Gd-aptâmero, resultando num aumento da emissão de fluorescência. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> Figura 1. O sensor (Gd-sensor) que consiste no longo aptâmero 44-base (Gd-aptâmero) marcados com fluoresceína (um fluoróforo) e a cadeia de 13 bases de comprimento têmpera (QS) etiquetada com DABCYL (um inibidor escuro) . Na ausência de não quelatada Gd3 +, a fluorescência do sensor é mínima. Com adição de Gd3 +, o deslocamento do QS ocorre e um aumento na emissão de fluorescência é observado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Não existe, actualmente, um método baseado em espectroscopia vulgarmente utilizado para detectaring aquosa 3+ D&#39;us. Este ensaio utiliza o alaranjado de xilenol molécula, que sofre uma mudança no comprimento de onda máximo de absorção 433-573 nm após a quelação com o ião 10. A razão entre estes dois valores máximos de absorvância pode ser usado para quantificar a quantidade de não quelatada Gd3 +. O sensor de aptâmero é uma alternativa (também pode ser complementar) para o ensaio de laranja de xilenol, como os dois métodos têm diferentes condições de reacção (tais como o pH e a composição das soluções tampão utilizadas), selectividades alvo, gamas lineares de quantificação, e as modalidades de detecção 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptâmero</td><td>IDTDNA</td><td>Sequência de entrada e modificação do fluoróforo na forma de pedido</td><td>Um fluoróforo com um comprimento de onda de emissão diferente pode ser usado. O aptâmero também pode ser encomendado a outra empresa.</td></tr><tr><td>Fita de têmpera</td><td>IDTDNA</td><td>Sequência de entrada e modificação do atenuador no formulário de pedido</td><td>Um atenuador diferente para transferência de energia ideal do fluoróforo pode ser usado. O aptâmero também pode ser encomendado a outra empresa.</td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td>de grau de biologia molecular</td><td>Nenhum fabricante específico, tanto o DEPC quanto o não tratado com DEPC funcionam igualmente bem</td></tr><tr><td>Cloreto de gadolínio (III) anidro</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio anidro</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>327300025</tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td> corrosivo <td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Placas NBS de</td></tr><tr><td>poliestireno de fundo plano preto de flange baixa de 384 poços tóxico e corrosivo Placas NBS</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>que são adequadas para fluorescência leitura são obrigatórias.</td></tr><tr><td>Filtro de topo de garrafa descartável estéril Nalgene Rapid-Flow</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>A tampa da garrafa está equipada com membrana PES de 0,2 mícron</td></tr><tr><td>Frascos estéreis descartáveis 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>Pode ser usada uma garrafa maior ou menor Tubos</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Nenhum fabricante específico, desde que sejam livres de DNAse e RNAse</td></tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td> <td>de PCR de 0,2 mLNenhum fabricante específico, desde que sejam Micropipetas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> livres de DNAse e RNAse <td>Nenhum fabricante específico</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (sem filtro) de tamanhos apropriados</td><td></td><td></td><td>Nenhum fabricante específico, desde que sejam livres de DNAse e RNAse</td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte>Leitor de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>placas</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Leitores de placas de outros fabricantes funcionariam igualmente bem</td></tr></tbody></table>

um sensor baseado em aptamer para não quelatada gadolínio (iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Um método para determinar a presença de íon gadolínio trivalente não quelado (Gd3+) em solução aquosa é demonstrado. O Gd3+ está frequentemente presente em amostras de agentes de contraste à base de gadolínio como resultado de reações incompletas entre o ligante e o íon, ou como um produto de dissociação. Como o íon é tóxico, sua detecção é de importância crítica. Aqui, o projeto e o uso de um sensor baseado em aptâmero (sensor Gd) para Gd3+ são descritos. O sensor produz uma mudança de fluorescência em resposta ao aumento das concentrações do íon e tem um limite de detecção na faixa nanomolar (~ 100 nM com uma relação sinal-ruído de 3). O ensaio pode ser executado em um tampão aquoso em pH ambiente (~ 7 - 7,4) em uma microplaca de 384 poços. O sensor é relativamente não reativo em relação a outros íons metálicos fisiologicamente relevantes, como íons sódio, potássio e cálcio, embora não seja específico para Gd3+ em relação a outros lantanídeos trivalentes, como európio (III) e térbio (III). No entanto, os lantanídeos não são comumente encontrados em agentes de contraste ou nos sistemas biológicos, e o sensor pode, portanto, ser usado para determinar seletivamente o Gd3+ não quelatado em condições aquosas.

Uma mudança de fluorescência típica da solução de Gd-sensor na presença de não quelatada Gd3 + é mostrada na Figura 2. A emissão pode ser representada graficamente como a mudança de fluorescência vezes (Figura 2A) ou a fluorescência em bruto leitura (Figura 2B) em unidades arbitrárias (AFU). Ambos os lotes se obter curvas de calibração muito semelhantes, com um intervalo linear de concentrações de Gd 3+ abaixo de 1 ...

O uso de moléculas de polidesoxinucleotídeo (aptâmero de 44 meros) para detectar o íon gadolínio (III) não quelado em uma solução aquosa é descrito. A presença do íon é detectada por meio de um aumento na emissão de fluorescência do sensor.

Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

O objetivo geral deste ensaio baseado em fluorescência é detectar a presença de íon de gadolínio tóxico não quelado em soluções aquosas contendo agentes de contraste para imagem por ressonância magnética. Este método pode ajudar a facilitar os agentes de contraste para RM baseados em gadolínio, fornecendo um meio para garantir alta paridade dos agentes sintetizados. A principal vantagem desta técnica é sua capacidade de detectar concentrações submicromolares de gadolínio tóxico não quelado com seletividade relativamente alta em relação a outros cátions metálicos biológicos.Para iniciar este procedimento, prepare o tampão de ensaio conforme descrito no protocolo textual. Utilizando hidróxido de sódio e ácido clorídrico, ajuste o pH para 7,4. Em seguida, filtre o tampão através de um filtro descartável estéril acoplado à boca do frasco com membrana PES de 0,2 mícron.Em seguida, transfira 497 microlitros do tampão de ensaio para um tubo novo de microcentrífuga. Adicione um microlitro da solução estoque do aptâmero de gadolínio preparada e dois microlitros da solução estoque de QS preparada. Transfira 50 microlitros dessa solução sensora de gadolínio 2X para cada um dos nove tubos de P

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Química

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É apresentado um protocolo para a seleção em vitro e caracterização de aptamers de DNA de ligação éster ácido ftálico de grupo específico. A aplicação do aptamer selecionado em um aptasensor eletroquímico também está incluída.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

Aqui, apresentamos um protocolo para obter68Ga núcleo dopado com óxido de ferro nanopartículas através de rápido orientado para o microondas síntese. A metodologia processa PET/nanopartículas de MRI (T1) com eficiência superior a 90% e a pureza radioquímica de 99% em uma síntese de 20 min de radioativos.

Síntese de nanopartículas de núcleo dopado com óxido de ferro Ga 68para tomografia por emissão de pósitrons Dual/imagem latente de ressonância magnética de (T1)

O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

Descrevemos um ensaio fluorescente que pode confirmar de forma rápida e barata a capacidade de novos compostos de quelar o ferro. O ensaio mede a capacidade dos compostos de superar a atividade de ligação de ferro da fraca sonda fluorescente quelante de ferro Calceína, resultando em um aumento quantificável na fluorescência quando ocorre a quelação.

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro 

Aprenda a detectar íons de gadolínio não quelatados tóxicos usando ensaio baseado em fluorescência com aptâmeros. Este método oferece alta sensibilidade e seletividade para garantir a segurança de agentes de contraste de ressonância magnética.

Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

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