Um sensor baseado em Aptamer para não quelatada gadolínio (III)

O objetivo geral deste ensaio baseado em fluorescência é detectar a presença de íon gadolínio não quelatado tóxico em soluções aquosas contendo agentes de contraste de ressonância magnética. Este método pode ajudar a facilitar os agentes de contraste de ressonância magnética à base de gadolínio, fornecendo um meio de garantir alta paridade de agentes sintetizados. A principal vantagem dessa técnica é que ela é capaz de detectar a concentração submicromolar de gadolínio tóxico não quelatado com seletividade relativamente alta em relação a outros cátions metálicos biológicos.

Para iniciar este procedimento, prepare o tampão de ensaio conforme descrito no protocolo de texto. Usando hidróxido de sódio e ácido clorídrico, ajuste o pH para 7,4. Em seguida, filtre o tampão através de um filtro descartável estéril com uma membrana PES de 0,2 mícron.

Em seguida, transfira 497 microlitros do tampão de ensaio para um tubo de microcentrífuga novo. Adicione um microlitro de solução estoque de aptâmero de gadolínio preparada e dois microlitros de solução estoque QS preparada. Transfira 50 microlitros desta solução de sensor de gadolínio 2X para cada um dos nove tubos de PCR.

Depois disso, coloque os tubos em um termociclador. Defina o termociclador para aquecer as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie lentamente as soluções a 25 graus Celsius durante 15 minutos. É importante lembrar de aquecer as soluções do sensor de gadolínio 2X a 95 graus, seguido de resfriamento lento à temperatura ambiente antes de adicionar a solução de íons de gadolínio.

Para começar, dissolva o tricloreto de gadolínio sólido no tampão do ensaio para criar uma solução de três estoques de gadolínio na concentração desejada. Utilizando a diluição em série, preparar seis soluções de gadolínio de 100 microlitros e três soluções, conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, dissolva o agente de contraste a ser testado no tampão do ensaio.

Use diluição em série para preparar três concentrações diferentes. Em seguida, remova os tubos de PCR contendo a solução do sensor de gadolínio 2X do termociclador. Transfira 50 microlitros de cada solução de gadolínio três para separar os tubos de PCR.

Pipete cada solução para cima e para baixo várias vezes para misturar. Em seguida, transfira 50 microlitros de cada solução de agente de contraste separadamente para os tubos de PCR restantes. Misture pipetando para cima e para baixo várias vezes.

Incubar todas as nove soluções durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois disso, transfira 45 microlitros de cada solução para uma placa de 384 poços em duplicatas. Em seguida, registre e analise os dados de fluorescência conforme descrito no protocolo de texto.

Neste estudo, o íon gadolínio trivalente não quelatado é detectado em solução aquosa usando um método baseado em fluorescência. O sensor fluorescente é desenvolvido anexando um fluoróforo ao aptâmero. O sensor é então hibridizado com uma fita de têmpera, que é marcada com uma molécula de têmpera escura.

A adição de gadolínio três desloca a fita de têmpera do aptâmero, causando um aumento na emissão de fluorescência. As curvas de calibração são obtidas usando aptâmero de gadolínio 100 nanomolar e QS 200 nanomolar e plotadas por fluorescência bruta ou mudança de dobra de fluorescência. Ambas as curvas mostram uma faixa linear para gadolínio três concentrações abaixo de um micromolar e saturação do sinal em concentrações acima de três micromolares.

Dois lotes diferentes de ácido gadotérico são então analisados para concentrações que variam de zero milimolar a 20 milimolares. Embora a emissão de fluorescência da amostra de alta pureza não aumente visivelmente nessa faixa, observa-se uma mudança significativa na amostra contendo gadolínio não quelatado três em concentrações tão baixas quanto cinco milimolares. Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de que não haja bolhas de ar nos poços da microplaca, pois isso alterará a leitura fluorescente.

Usando este procedimento, podemos detectar até mesmo pequenas quantidades de íons de gadolínio calculados em soluções contendo agentes de contraste. Este será um bom método para determinar a pureza dos agentes. Trabalhar com produtos químicos pode ser perigoso e tomar precauções, como usar equipamentos de proteção individual, é importante ao realizar esse procedimento.