Märkning hESCs och hMSCs med nanopartiklar av järnoxid för icke-invasiv in vivo-spårning med MR

Märkning av hMSC med Ferucarbotran

Detta är den teknik för märkning mänskliga mesenkymala stamceller med Ferucarbotran, en järnoxid baserat kontrastmedel för MR-avbildningar:

1. Till att börja med platta celler 18-24 timmar innan märkningen förfarandet i T75 kolvar vid en sammanflödet av 80%. Om du använder en annan kultur maträtt, är detta lika med ca 10000 celler per cm ^2.
2. Nästa dag, börja med förbereda märkning medierna genom att tillsätta 30 ìl av Resovist till 8 ml serum fria medier. Detta kommer att etiketten en T75 kolv vid 80% confluency, motsvarande en koncentration av 100 mikrogram Fe / ml medier.
3. Ta av odlingsmedia och tvätta cellerna en gång med PBS eller serum-fria medier. Detta görs för att få bort kvarvarande serum-proteiner och andra beståndsdelar i de medier som kunde binda kontrastmedlet och inflytande märkning effektivitet.
4. Lägg märkningen media till kolven och sätta kolven tillbaka i inkubatorn.
5. Efter 2 timmar, tillsätt 2 ml FCS så att en slutlig koncentration av 20% FCS uppnås. Detta görs för att säkerställa att cellerna inte får stimulans att differentiera, men i stället växer i sin invanda miljö.
6. Inkubera cellerna över 18 timmar. Detta görs bäst över en natt.
7. Nästa dag, spola cellerna med PBS, sedan trypsinize dem som vanligt.
8. När trypsinized behöver cellsuspension som ska tvättas tre gånger för att bli av med rester, gratis kontrastmedel i media. Detta görs med PBS centrifugering av celler vid 400 RCF i 5 minuter.
9. Den slutliga cellpelleten kan återsuspenderat och är klar för ytterligare experiment.
10. Räkna celler som nu, som vissa kan ha gått förlorade under föregående tvätt steg. Dessutom utför livskraft testa på denna punkt med Trypan blå uteslutning analys och ta lite prover för spektrometrisk analys för att mäta märkning effektivitet.

Märkning av mänskliga embryonala stamceller med Ferumoxides

1. Till att börja med plattan i hESC i 10cm rätter, som vanligt. Dessa rätter är redan belagda med gelatin och har bestrålat feeder celler på dem. Du kan använda detta protokoll för feeder-fri kulturer också.
2. Låt hESC fästa och växa i ca 3-4 dagar så att de bildar medelstora kolonier. Under denna tid, se till att kolonierna inte växer till stora, som större kolonier är svårare att bryta upp senare.
3. Differentierade celler kan förorena dessa kulturer, så beroende på renligheten i kolonierna, du kanske bli av med differentierade kulturer genom dissektion.
4. Förbered märkning media som består av Ferumoxides vid en koncentration av 100μg/ml och full hESC medier. För detta blandar vi 89μl Ferumoxides och 10 ml av full tillväxt medier.
5. Tvätta skålen gång med komplett media.
6. Tillsätt 10 ml av märkning medier per fat och inkubera celler i 4 timmar.
7. Nu är märkningen klar. I nästa steg är det nödvändigt att tvätta cellerna och få en enda cell suspension för vidare användning. För detta, skölj skålen med PBS.
8. Sedan byter PBS med 5 ml 0,25% Trypsin och inkubera i inkubatorn i 5 minuter, eller tills cellerna lossnar. Det bidrar till att peka på skålen ofta.
9. Cellerna har nu lossnat. Tänk på att om skålen innehöll större kolonierna det kan finnas några kvar klumpar.
10. För att bli av med dessa klumpar kan man blanda hela suspension en gång med hjälp av en serologisk pipett, så låt det sitta i ytterligare 2 minuter.
11. Vi använder inte ett Eppendorf-pipett, som upprepade suger av cellerna genom den tunna spetsen kan bryta cellmembranen.
12. Om rester av klumpar är närvarande, kan man köra cellsuspension genom en 40μm cell sil.
13. Om allt fungerat korrekt, det finns en enda cell fjädring nu att blandas med en massa skräp, som härstammar från gelatin beläggning, på ESC-matris och döda celler. För att bli av med detta, tvätta cellerna två gånger genom att snurra dem vid 400 RCF i 5 minuter och återsuspendera dem i full medier.
14. Nu behöver ESK kan isoleras från det bestrålade feeder celler. Detta kan göras effektivt genom bordläggning cellsuspensionen på en gelatin-coated skålen.
15. Om fatet inte är manipulerade, alla celler kommer sediment ner, men matare att fästa snabbare än ESK.
16. Så om supernatanten tas av efter 45 minuter, bör det främst innehåller ESC, medan matare bör främst knytas till skålen.
17. Detta sätt är en enda cell suspension av magnetiskt märkt mänskliga embryonala stamceller som kan användas för ytterligare experiment erhålls.
18. Liksom i det tidigare protokollet på denna punkt, måste du räkna celler och ta prover för livskraft bedömning och mätning av märkning effektivitet.

En icke-invasiv skildring av stamceller är avgörande för att övervaka praktiskt taget alla stamcellsbaserade terapi. En bättre förståelse av in vivo kinetiken av märkta stamceller, som visualiseras på MR-bilder kan leda vägen till en rationell och en effektivare användning av stamceller-baserade behandlingar. Eftersom vi använder kliniskt tillämpliga kontrastmedel och avbildningstekniker, bör våra presenteras protokoll vara lätt att överföra till program i patienter. Potentiella kliniska tillämpningar av våra metoder omfattar jämförande undersökningar av engraftment processen av olika subtyper stamceller eller genmanipulerade stamceller, liksom, bedömning av terapi inverkan på utfallet av stamceller engraftment. Resultat ska omedelbart hjälp i preklinisk bedömningar av Stem-baserade terapier, vid utformningen av relaterade kliniska prövningar, och senare, vid bedömningen av dessa stamceller cellbaserade terapier i klinisk praxis. Att notera är vår bildteknik också tillämplig på andra populationer stamceller, som hematopoetiska stamceller eller neuronala stamceller.