Étiquetage CSEh et hMSCs d'oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec IRM

Pour l'évaluation de nouvelles thérapies de cellules souches, il est important de suivre de manière non invasive des cellules injectées in vivo. Cette vidéo va vous montrer comment étiqueter cellules souches mésenchymateuses humaines et embryonnaires avec des agents de contraste à base d'oxyde de fer in vivo pour subséquentes IRM in vivo.

Bienvenue dans le laboratoire du Dr.Haiku Dal Link. Nous tenons à remercier le California Institute of Regenerative Medicine d’avoir financé ce projet d’évaluation de nouvelles thérapies à base de cellules souches. Il est important de suivre de manière non invasive les cellules injectées in vivo.

Cela est possible en marquant les cellules in vitro avec des agents de contraste spécifiques ou multifonctionnels pour l’imagerie IRM ou l’imagerie optique. Cette vidéo vous montrera comment étiqueter les cellules souches mésenchymateuses humaines et embryonnaires humaines pour une imagerie in vivo ultérieure. Bonjour, je m’appelle Tobias Henning et je travaille du groupe de recherche sur les agents de contraste du Center for Molecular and Functional Imaging du département de radiologie de l’Université de Californie à San Francisco.

Aujourd’hui, je vais vous montrer les procédures de marquage in vitro des cellules souches mésenchymateuses humaines avec du peric, de la carone, et des cellules souches embryonnaires humaines avec des oxydes de phém. Cette technique est utile pour localiser les cellules injectées in vivo ou pour obtenir des informations sur leur état fonctionnel. Les procédures de marquage cellulaire avec un agent conscient IRM varient pour les cellules souches embryonnaires et mésenchymateuses, mais les deux techniques impliquent les étapes suivantes, la préparation de la culture cellulaire qui est le placage des cellules conformément aux cultures cellulaires, la préparation du marquage, le marquage des cellules par incubation simple, la trypsine des cellules souches et l’évaluation de l’efficacité du marquage et de la viabilité cellulaire.

Commençons donc par étiqueter quelques cellules. Commençons maintenant par le marquage des cellules souches mésenchymateuses avec Theo Carbatrol. Tout d’abord, je montrerai la technique de marquage des cellules souches mésenchymateuses humaines avec du théo carron et un agent de contraste à base d’oxyde de fer pour l’imagerie par résonance magnétique.

Pour commencer, nous plaquons les cellules 18 à 24 heures avant la procédure d’étiquetage dans des flacons T 75 à une confluence de 80 %Sinon, si vous utilisez une autre boîte de culture qui équivaut à environ 10 000 cellules par centimètre carré le lendemain, nous commençons par préparer le milieu d’étiquetage en ajoutant 30 microlitres de réserviste à huit millilitres de milieu sans sérum. Cela permettra d’étiqueter un T 75 FLA à une tolérance de 80 % et correspond à une concentration de cent microgrammes de fer par millilitre de milieu. Maintenant, nous enlevons le milieu de culture et lavons les cellules une fois avec du PBS ou un milieu sans sérum.

Nous faisons cela pour nous débarrasser des protéines sériques résiduelles et d’autres constituants du milieu qui pourraient lier les agents de contraste et influencer l’efficacité du marquage. Ajoutez le support d’étiquetage dans le ballon et remettez-le dans l’incubateur. Au bout de deux heures, ajoutez deux ml de FCS de manière à obtenir une concentration finale de 20 % de FCS.

Nous faisons cela pour nous assurer que les cellules ne reçoivent aucun stimulus pour différencier qu’il est mort et qu’il pousse dans leur environnement familier. Maintenant, nous incubons les cellules pendant 18 heures. Le lendemain, nous rinçons les cellules avec du PBS, puis nous les gazotons selon les protocoles de culture standard afin de nous débarrasser de l’agent de contraste libre.

Une fois Tryps inisé, la suspension cellulaire est lavée trois fois par centrifugation à 400 RCF pendant cinq minutes, puis réustimement en suspension dans PBS. Voilà. La cellule P finale peut être remise en suspension et est prête pour d’autres expériences.

Nous comptons les cellules maintenant car nous avons peut-être perdu certaines lors des étapes de lavage précédentes. Nous effectuons également des tests de viabilité à ce stade à l’aide du test d’exclusion du bleu trippin et prélevons quelques échantillons pour une analyse spectrométrique afin de mesurer l’efficacité du marquage. Permettez-moi maintenant de vous montrer comment marquer les cellules souches embryonnaires humaines avec des oxydes de phèmes.

Pour commencer, nous plaçons les cellules souches embryonnaires humaines dans des boîtes de 10 centimètres. Comme d’habitude, ces plats sont précodés avec de la gélatine et contiennent des cellules nourricières irradiées. Vous pouvez également utiliser ce protocole pour les cultures sans nourrissages.

Nous laissons les cellules souches embryonnaires humaines se fixer et croître pendant environ trois à quatre jours afin qu’elles forment des colonies de taille moyenne. Pendant ce temps, nous veillons à ce que les colonies ne deviennent pas trop grandes car les grandes colonies sont plus difficiles à briser. Plus tard, des cellules différenciées peuvent contaminer ces cultures.

Ainsi, en fonction de la propreté des colonies, nous devrons peut-être nous débarrasser des cultures différenciées par dissection. Maintenant, nous préparons le milieu de marquage qui se compose d’oxydes de théorème à une concentration de cent microgrammes de fer par millilitre et de milieux complets de cellules souches embryonnaires humaines. Pour cela, nous mélangeons 89 microlitres, des oxydes de phém et 10 millilitres de milieu de croissance complet.

En ce qui concerne les cellules souches mésenchymateuses, nous lavons une fois le plat avec un milieu complet pour se débarrasser des cellules mortes ou des débris. Ensuite, nous ajoutons 10 millilitres de support d’étiquetage par plat et incubons les cellules pendant quatre heures. L’étiquetage est maintenant terminé.

Dans l’étape suivante, nous devons laver les cellules et obtenir une suspension à cellule unique. Pour une utilisation ultérieure Pour cela, nous rinçons d’abord le plat avec du PBS. Nous remplaçons maintenant le PBS par cinq millilitres de 0,25 % de trypsine et incubons pendant cinq minutes dans l’incubateur ou jusqu’à ce que les cellules se détachent.

Il est utile de tapoter fréquemment la parabole, les cellules se sont maintenant détachées. Gardez à l’esprit que si la parabole contenait de plus grandes colonies, il pourrait s’agir de quelques touffes restantes pour se débarrasser de ces amas Nous mélangeons soigneusement toute la suspension en pipetant de haut en bas, à l’aide d’une pipette sérologique, puis nous la laissons reposer pendant deux minutes supplémentaires.

Dans la trypsine. Nous n’utilisons pas de pipette Eppendorf car le pipetage répété des cellules à travers la pointe fine peut briser les membranes cellulaires si tout fonctionne correctement. Nous avons maintenant une suspension unicellulaire qui est mélangée à beaucoup de débris provenant de la gélatine recouvrant la matrice de cellules souches embryonnaires et des cellules mortes.

Nous pouvons maintenant nous débarrasser des amas ou des complexes restants en faisant passer les cellules à travers une crépine de cellules de 40 micromètres. Nous devons maintenant isoler les cellules souches embryonnaires humaines des cellules nourricières irradiées. Cela peut être fait efficacement en plaquant la suspension cellulaire sur un plat recouvert de gélatine.

Si nous ne manipulons pas la boîte, toutes les cellules se sédimenteront, mais les mangeoires se fixeront plus rapidement que les cellules souches embryonnaires humaines. Donc, si nous enlevons le SUP natin après 45 minutes, il devrait contenir principalement des cellules souches embryonnaires humaines, tandis que les mangeoires devraient principalement être attachées à la parabole. De cette façon, nous obtenons une suspension cellulaire unique de cellules souches embryonnaires humaines marquées magnétiquement qui peuvent être utilisées pour d’autres expériences comme dans le protocole précédent.

À ce stade, vous devez compter les cellules et prélever des échantillons pour l’évaluation de la viabilité et la mesure de l’efficacité de l’étiquetage. Voilà qui termine les protocoles que je voulais vous montrer aujourd’hui. Voyons maintenant comment nous pouvons suivre les cellules souches marquées in vivo.

Cette diapositive montre des cellules souches marquées par OC Carone. Après qu’elles aient été injectées dans le cerveau d’une souris, nous avons suspendu 20 000 cellules dans un volume de 75 nanolitres et les avons injectées dans la zone sous-ventriculaire. L’oxyde de fer dans les cellules implantées provoque un artefact de sensibilité qui peut être vu sur l’IRM. Images.

Nous venons de vous montrer comment étiqueter les cellules souches embryonnaires et mésenchymateuses. In vitro avec les agents Mr.Contrast qui suivent les cellules souches mésenchymateuses et embryonnaires in vivo présente un énorme potentiel pour évaluer de nouvelles thérapies à base de cellules souches. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance avec l’étiquetage de vos cellules.