Name: Étiquetage CSEh et hMSCs doxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in vivo avec IRM (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Découvrez le marquage de cellules souches mésenchymateuses et embryonnaires humaines avec des agents de contraste à base d'oxyde de fer pour l'imagerie IRM. Cette méthode permet le suivi non invasif in vivo des cellules injectées.

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Ce projet a été soutenu par une subvention Leon J. Thal SEED du California Institute for Regenerative. Tobias Henning a été financée par une allocation de recherche de l&#39;Association allemande de recherche (DFG, SE 4578/1-2). Nous voulons remercier chaleureusement Meneses Juanito pour ses conseils sur la culture de cellules souches embryonnaires humaines.

Étiquetage des hMSC avec Ferucarbotran C&#39;est la technique pour l&#39;étiquetage cellules souches mésenchymateuses humaines avec des Ferucarbotran, un oxyde de fer agent de contraste pour l&#39;IRM basées: <ol><li> Pour commencer, plaque les cellules 18-24 heures avant la procédure de labellisation dans les flacons T75 à une confluence de 80%. Si vous utilisez une boîte de culture différente, il est égal à environ 10 000 cellules par cm 2. </li><li> Le lendemain, commencer par préparer le support d&#39;étiquetage en ajoutant 30 pl de Resovist à 8 ml de sérum de médias libres. Ce sera une étiquette de flacon T75 à 80% de confluence, correspondant à une concentration de 100 ug Fe / ml médias. </li><li> Enlever les milieux de culture et laver les cellules une fois avec du PBS ou du milieu sans sérum. Ceci est fait pour se débarrasser des protéines sériques résiduelles et d&#39;autres constituants des médias qui pourrait lier l&#39;agent de contraste et de l&#39;efficacité d&#39;étiquetage influence. </li><li> Ajouter les médias d&#39;étiquetage dans le ballon et remettre le ballon dans l&#39;incubateur. </li><li> Après 2 heures, ajouter 2 ml de SVF de telle sorte que la concentration finale de 20% de FCS est atteint. Ceci est fait pour s&#39;assurer que les cellules ne reçoivent pas de relance de différencier, mais plutôt à grandir dans leur environnement familier. </li><li> Incuber les cellules pendant 18 heures. Il est préférable de faire en une nuit. </li><li> Le lendemain, rincez-les cellules avec du PBS, puis trypsiniser comme d&#39;habitude. </li><li> Une fois trypsinées, la suspension cellulaire doit être lavé trois fois pour se débarrasser des matières résiduelles, sans agent de contraste dans les médias. Ceci est fait avec du PBS centrifugation les cellules à 400 rcf pendant 5 minutes. </li><li> Le culot cellulaire final peut être remis en suspension et est prêt pour de nouvelles expériences. </li><li> Compter les cellules maintenant, comme certains pourraient avoir été perdus au cours des étapes précédentes à laver. En outre, effectuer des tests de viabilité à ce point en utilisant le test d&#39;exclusion au bleu Trypan et prendre quelques échantillons pour analyse par spectrométrie de mesurer l&#39;efficacité d&#39;étiquetage. </li></ol> Étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines avec Ferumoxides <ol><li> Pour commencer, la plaque du CSEh dans des plats de 10cm, comme d&#39;habitude. Ces plats sont pré-enduites de gélatine et de cellules nourricières irradiées ont sur eux. Vous pouvez utiliser ce protocole pour le chargeur sans cultures. </li><li> Laissez les CSEh attacher et croître pendant environ 3-4 jours de sorte qu&#39;ils forment des colonies moyennes entreprises. Pendant ce temps, s&#39;assurer que les colonies ne poussent pas à la grande, que les grandes colonies sont plus difficiles à briser plus tard. </li><li> Les cellules différenciées peuvent contaminer ces cultures, si en fonction de la propreté des colonies, vous pouvez avoir à se débarrasser des cultures différenciées par la dissection. </li><li> Préparer les médias d&#39;étiquetage qui consiste Ferumoxides à une concentration des médias sur les CSEh 100μg/ml et complète. Pour cela, nous mélangeons 89μl Ferumoxides et 10 ml de milieu de croissance complet. </li><li> Laver la vaisselle une fois avec les médias complet. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;étiquetage des médias par plat et incuber les cellules pendant 4 heures. </li><li> Maintenant, l&#39;étiquetage est complet. Dans la prochaine étape, il est nécessaire de laver les cellules et obtenir une suspension cellulaire unique pour une utilisation ultérieure. Pour cela, d&#39;abord rincer la vaisselle avec du PBS. </li><li> Ensuite, remplacez le PBS avec 5 ml de trypsine à 0,25% et incuber dans l&#39;étuve pendant 5 minutes, ou jusqu&#39;à ce que les cellules se détachent. Il aide à exploiter le plat fréquemment. </li><li> Les cellules ont désormais détaché. Gardez à l&#39;esprit que si le plat contenait de plus grandes colonies pourrait y avoir quelques bouquets gauche. </li><li> Pour se débarrasser de ces amas, on peut mélanger toute la suspension une fois en utilisant une pipette sérologique, puis laissez-le reposer pendant 2 minutes. </li><li> Nous n&#39;utilisons pas une pipette Eppendorf, sucer comme répétées des cellules à travers la pointe fine peut rompre les membranes cellulaires. </li><li> Si les mottes résiduelles sont présentes, on peut exécuter la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire 40μm. </li><li> Si tout marche correctement, une suspension cellulaire unique existe maintenant qui est mélangée avec beaucoup de débris, provenant de la couche de gélatine, l&#39;ESC-matrice et les cellules mortes. Pour se débarrasser de cela, laver les cellules deux fois plus bas en les faisant tourner à 400 rcf pendant 5 minutes et les remettre en suspension dans un milieu complet. </li><li> Maintenant, le CES doit être isolé de la cellules nourricières irradiées. Cela peut être fait efficacement par étalement de la suspension cellulaire sur un plat de gélatine-enduit. </li><li> Si le plat n&#39;est pas manipulé, toutes les cellules seront sédiments vers le bas, mais les mangeoires attachera plus vite que la CES. </li><li> Donc, si le surnageant est retiré après 45 minutes, il devrait contenir essentiellement ESC, alors que les mangeoires doivent être principalement attaché à l&#39;antenne. </li><li> De cette façon, une suspension cellulaire unique marquées magnétiquement cellules souches embryonnaires humaines qui peuvent être utilisées pour d&#39;autres expériences est obtenu. </li><li> Comme dans le précédent protocole, à ce stade, vous avez besoin de compter les cellules et prélever des échantillons pour l&#39;évaluation de la viabilité et l&#39;efficacité de la mesure d&#39;étiquetage. </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

Une représentation non-invasive de cellules souches est cruciale pour le suivi pratiquement toutes les thérapies cellulaires basées. Une meilleure compréhension de la cinétique in vivo des cellules souches étiquetées, comme visualisées sur les images IRM, pourrait ouvrir la voie à une utilisation rationnelle et une utilisation plus efficace de base de cellules souches thérapies. Puisque nous utilisons des agents de contraste cliniquement applicables et les techniques d&#39;imagerie, nos protocoles présentés doivent être facilement traduisib...

<table><tbody><tr><td>D-MEM à forte concentration de glucose</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>diluer la gélatine dans le PBS à une concentration finale de 0,1 %</td></tr><tr><td>PBS (sans Ca++ ni Mg++)</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05 %</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25 %</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin caractérisé</td><td>Réactif</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Filtre cellulaire (40 &amp;mu;m en nylon)</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Substitut de sérum Knockout</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Réactif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td>Réactif</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferucarbotran (Resovist&amp;#174;)</td><td>Réactif</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage cseh et hmscs d&#39;oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec irm

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Ces dernières années, la recherche sur les cellules souches a conduit à une meilleure compréhension de la biologie du développement, de maladies diverses et son impact potentiel sur la médecine régénérative. Une méthode non-invasive pour surveiller les cellules souches transplantées plusieurs reprises in vivo serait grandement améliorer notre capacité à comprendre les mécanismes qui la mort des cellules souches et de contrôle d&#39;identifier les facteurs trophiques et voies de signalisation qui permettent d&#39;améliorer la prise de greffe de cellules souches. IRM a été prouvé être un outil efficace pour la représentation en in vivo des cellules souches avec une résolution proche anatomiques microscopiques. Afin de détecter les cellules souches avec MR, les cellules doivent être étiquetés avec des cellules spécifiques des agents de contraste IRM. A cet effet, les nanoparticules d&#39;oxyde de fer, tels que les particules d&#39;oxyde de fer superparamagnétique (SPIO), sont appliquées, en raison de leur grande sensibilité pour la détection de cellules et de leur excellente biocompatibilité. Particules SPIO sont composées d&#39;un noyau d&#39;oxyde de fer et un manteau de dextrane, carboxydextran ou de l&#39;amidon, et la fonction en créant des inhomogénéités de champ local, qui causent une diminution du signal sur les images IRM pondérées en T2. Cette présentation fera la démonstration des techniques de marquage des cellules souches avec cliniquement applicables agents de contraste IRM pour subséquentes non-invasive dans le suivi in ​​vivo des cellules marquées avec l&#39;IRM.

Pour l&#39;évaluation de nouvelles thérapies de cellules souches, il est important de suivre de manière non invasive des cellules injectées in vivo. Cette vidéo va vous montrer comment étiqueter cellules souches mésenchymateuses humaines et embryonnaires avec des agents de contraste à base d&#39;oxyde de fer in vivo pour subséquentes IRM in vivo.

Étiquetage CSEh et hMSCs d&#39;oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec IRM

Ces dernières années, la recherche sur les cellules souches a permis de mieux comprendre la biologie du développement, diverses maladies et son impact potentiel sur la régénération...

Bienvenue dans le laboratoire du Dr. Haiku Dal Link. Nous tenons à remercier l'Institut de médecine régénérative de Californie pour le financement de ce projet visant à évaluer de nouvelles thérapies par cellules souches. Il est important de suivre de manière non invasive les cellules injectées in vivo.Cela est possible en marquant les cellules in vitro à l'aide d'agents de contraste spécifiques ou multifonctionnels pour l'imagerie par résonance magnétique ou l'imagerie optique. Cette vidéo vous montrera comment marquer des cellules souches mésenchymateuses humaines et des cellules souches embryonnaires humaines en vue d'une imagerie subséquente in vivo. Bonjour, je suis Tobias Henning, du groupe de recherche sur les agents de contraste au Centre d'imagerie moléculaire et fonctionnelle du Département de radiologie de l'Université de Californie à San Francisco.Aujourd'hui, je vais vous présenter les protocoles de marquage in vitro de cellules souches mésenchymateuses humaines avec du peric, du carone, et de cellules souches embryonnaires humaines avec des oxydes de phem. Cette technique est utile afin de localiser les cellules injectées in vivo ou d'obtenir des informations sur leur

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Cette vidéo montre des techniques pour l'étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches mésenchymateuses avec des colorants fluorescents. Cette technique peut être utilisée pour un suivi in ​​vivo des cellules souches transplantées avec l'imagerie optique et des corrélations histopathologiques avec la microscopie à fluorescence.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Dans cette vidéo, nous montrons comment étiqueter cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec du chlorure de manganèse...

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Objectif de la présentation est de montrer une méthode hautement reproductible pour générer la matrice associée implants de cellules souches dans les lésions du cartilage, qui peuvent être visualisées avec l'IRM. Les cellules souches sont étiquetés avec approuvée par la FDA Ferumoxides, mélangés avec l'agarose, implantés dans les lésions du cartilage et imagé avec un scanner IRM 7T.

Implantation de Ferumoxides Étiqueté cellules souches mésenchymateuses humaines dans les lésions du cartilage

Méthodes de bio-imagerie utilisées pour évaluer la biodistribution des cellules de nanoparticules sont applicables pour la surveillance thérapeutique et diagnostique de composés nanoformulated. Les méthodes décrites ici sont sensibles et spécifiques lorsqu'ils sont évalués par des coregistration histologique. Les méthodologies de fournir une voie de translation des rongeurs à des applications humaines.

Bioimaging enregistré des nanomatériaux pour la surveillance des services diagnostiques et thérapeutiques

Nous décrivons une technique d'étiquetage et de suivi avec des cellules souches approuvé par la FDA, le fer superparamagnétiques d'oxyde (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Cette technique d'imagerie cellulaire qui utilise par résonance magnétique (IRM) pour la visualisation, est facilement accessible pour surveillance à long terme et le diagnostic de succès ou non engraftments cellules souches chez les patients.

Étiquetage cellules souches avec Ferumoxytol, une nanoparticule approuvé par la FDA d&#39;oxyde de fer

Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

Suivi des cellules en utilisant l'IRM a attiré l'attention remarquable dans les dernières années. Ce protocole décrit le marquage des cellules dendritiques avec le fluor...

La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l&#39;imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Détails du Protocole sont prévus pour l'étiquetage des cellules souches in vitro d'embryons humains à des nanoparticules deuxième engendrent des harmoniques. Méthodologies d'enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques sont également présentés.

Harmonique nanoparticules régénératrice recherche

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

L’administration ciblée de cellules est utile dans diverses applications biomédicales.  L’objectif de ce protocole est d’utiliser des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) pour marquer les cellules et ainsi permettre des approches de ciblage cellulaire magnétique pour un haut degré de contrôle de l’administration et de la localisation des cellules.

Cellule étiquetage et le ciblage des nanoparticules d&#39;oxyde de fer Superparamagnetic

Présenté ici est un protocole pour la livraison non-invasive de cellules souches mésenchymales (MSC) et le suivi dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques. Les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic sont employées comme sonde d'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour l'étiquetage mSC et le suivi in vivo non invasif suivant la livraison intranasale utilisant l'IRM en temps réel.

Suivi des cellules souches mésenchymales étiquetées à l'oxyde de fer superparamagnetic à l'aide de l'IRM après la livraison intranasale dans un modèle de murine traumatique de lésions cérébrales

Découvrez le marquage de cellules souches mésenchymateuses et embryonnaires humaines avec des agents de contraste à base d'oxyde de fer pour l'imagerie IRM. Cette méthode permet le suivi non invasif in vivo des cellules injectées.

Étiquetage CSEh et hMSCs d'oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in vivo avec IRM

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