Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

1. Vorbereitung von Aktin

Die Quelle von Aktin in diesem Test verwendet wurde non-muscle menschlichen Blutplättchen (β-Aktin) von Zytoskelett Inc. Stock Aliquots bei 10 mg / ml in der -70 ° C Gefrierschrank aufbewahrt erhalten. Für den Test wird die Aktin bis 0,4 mg / ml in einem Puffer, enthaltend 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl _2, 0,2 mM ATP und 0,5 mM DTT, bei 20.000 g für 10 Minuten zentrifugiert bei 4 º C verdünnt Der Überstand, der monomeren Aktin ist bereit, polymerisiert werden. Aktin-Polymerisation wird durch Zugabe 50 mM KCl, 1 mM ATP und 2 mM MgCl ₂ induziert. Die Polymerisation erfolgt bei Raumtemperatur für 1 Stunde.

2. Zubereitung von Protein-

In diesem Test werden wir die Verwendung des C-Terminus von Talin, die als GST-markierte Protein wurde gereinigt. Das Protein im Assay verwendet werden soll, um eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation vor, frei von Aggregaten vor der Inkubation mit F-Aktin unterzogen.
Das Protein wird bei 100.000 g in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 20 min bei 22 º C gesponnen

3. Aktin-Protein-Inkubation

Der Betrag von Aktin und Protein in einem Test variieren. In diesem Beispiel verwenden wir Aktin im Übermaß. Normalerweise wird ein Molverhältnis berechnet, zB. einem 4:1 Molverhältnis von Aktin an Protein.

In den folgenden Assay wird die Endreaktionsvolumen 150 pl. Der Puffer, in dem die Protein-und F-Aktin inkubiert wird das Protein getestet werden und auf die notwendigen Voraussetzungen abhängig. In diesem Beispiel verwenden wir einen Puffer mit 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl ₂ und 2 mM MgCl _2. Die Protein-und F-Aktin sind in den Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

4. Sedimentation von F-Aktin

Nach der Inkubation werden die Proben bei 100.000 g bei 22 º C gesponnen Wir verwenden einen Beckman Ultrazentrifuge in dem Video. Der Rotor ist vorsichtig, um nicht auf die Pellets stören entfernt.

5. Analyse von Protein-Co-Sedimentation mit F-Aktin

Die Überstände werden sorgfältig durch Pipettieren in ein Eppendorf-Röhrchen und 5 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer entfernt wird aufgenommen. Eine entsprechende Volumen von 1 X Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer ist es, die Pellets noch hinzu, pipettiert rauf und runter, und in neue Eppendorf-Röhrchen. Die relativen Mengen an Protein in den Pellets und Überstände werden nach ihrer Trennung durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung des Gels oder Western-Blot analysiert.

Um die Spezifität der Protein-Interaktion mit Aktin zu bestimmen, Aktin abhängig von ihrer Konzentration co-Ablagerungen durchgeführt werden kann. Für diese Art von Experiment, eine feste Menge des Proteins und eine Reihe von steigenden Mengen an Aktin inkubiert, und die Analyse erfolgt wie oben beschrieben durchgeführt.

Aktin co-Sedimentation ist ein einfaches in vitro-Assay zur specfic Proteine ​​die Bindung an F-Aktin zu analysieren. In diesem Video zeigen wir ein Beispiel, wie eine einfache Aktin co-Sedimentation durchgeführt werden kann. Wir zeigen, wie F-Aktin vorbereiten, bereiten das Protein getestet werden und das Verfahren von Aktin co-Sedimentation. Eine Reihe von Punkten zu beachten bei der Durchführung von Aktin-Co-Sedimentation Assays werden. Zum Beispiel kann der Puffer-Komponenten für die Inkubation je nach Protein getestet und pH-Wert, Temperatur und Salzkonzentration kann die Bindung an F-Aktin beeinflussen. Wir haben eine einfache Bindung an F-Aktin, aber diese Art von Test kann ausgearbeitet werden und verwendet werden, um verbindliche Spezifität einer Protein-oder Protein-Domäne zu F-Aktin bestimmen demonstriert.