- أضف 500 ميكرولتر من مصفوفة مزيج PCR المشتراة إلى كل من أنبوبي الغطاء اللولبي 2 باستخدام ماصة نقل أو ماصة دقيقة قابلة للتعديل 200-1,000 ميكرولتر. الماصة لأعلى ولأسفل مع الماصة بين كل حصة لخلط مصفوفة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتساوي.
- قم بتسمية أنبوب الغطاء اللولبي "غير معدل وراثيا" والآخر "اختبار".
- قم بوزن 0.5 جرام من الطعام المعتمد غير المعدل وراثيا وضعه في الهاون.
- أضف 2.5 مل من الماء المقطر وطحنها بالمدقة لمدة دقيقتين لتشكيل ملاط.
- أضف 2.5 مل أخرى من الماء المقطر واستمر في الطحن بالمدقة حتى يصبح الملاط ناعما بدرجة كافية لسحب الماصة.
- Pipet 50 ميكرولتر من الملاط المطحون إلى أنبوب الغطاء اللولبي الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من الخلطة الجاهزة PCR المسماة "غير المعدلة وراثيا" باستخدام علامة 50 ميكرولتر على ماصة متدرجة. أنبوب الملخص.
- كرر الخطوات 1.3-1.6 لتحضير عينة طعام الاختبار.
- Pipet 50 ميكرولتر من ملاط طعام الاختبار الأرضي إلى أنبوب الغطاء اللولبي المسمى "اختبار". أنبوب الملخص.
- دوامة الطعام غير المعدلة وراثيا واختبار أنابيب PCR للأغذية لمدة 1 دقيقة ووضع الأنابيب في حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إذا لم تكن الدوامة متوفرة ، فقم بنفض الغبار عن الأنبوب عدة مرات للخلط قبل وضعه في حمام مائي.
- ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق. يجب أن تتشكل حبيبات صلبة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم تشكيل الحبيبات بعد 5 دقائق, جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 2 دقيقة حتى تتشكل الحبيبات.
- يمكن استخدام الأنابيب على الفور لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. إعداد تفاعلات PCR
- عدد أنابيب PCR 1-6 وأولية لهم. يجب أن تتوافق الأرقام مع محتويات الأنبوب التالية المدرجة في الجدول 1.
- ضع كل أنبوب PCR مسمى في حامل أنبوب دقيق مع أغطية مفتوحة.
- باستخدام طرف جديد لكل إضافة ، أضف 20 ميكرولتر من التمهيدي الموضح في الجدول 1 إلى كل أنبوب PCR. أنابيب الغطاء.
- باستخدام طرف جديد لكل أنبوب ، أضف 20 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الموضحة في الجدول 1 إلى كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع التأكد من الماصة فقط من المادة الطافية وتجنب الحبيبات الصلبة في قاع الأنابيب.
- بعد سحب كل عينة من عينة الحمض النووي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابل، استخدم الماصة لخلط الحمض النووي والبرايمر عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل؛ تلخيص الأنابيب.
- ضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري وقم ببرمجة جهاز التدوير من أجل:
التغيير الطبيعي الأولي: دورة واحدة عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين < br / > التضخيم: 40 دورة عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة (التنويذة) ، و 59 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة (التلدين) ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين (تمديد).
التمديد النهائي: دورة واحدة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق < / > الانتظار: 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
3. 3٪ تحضير جل الاغاروز
- باستخدام شريط لاصق أو لاصق ، قم بلصق الأطراف المفتوحة لصينية الجل بإحكام. تأكد من إغلاق الشريط على حواف الدرج لمنع تسرب الاغاروز المنصهر.
- قم بوزن 3 جم من الاغاروز في قارورة إرلينماير سعة 250 مل أو أكبر.
- أضف 100 مل من 1x TAE المؤقت (تم شراؤه أو تحضيره من المركز).
- باستخدام لوح تسخين مغناطيسي مع قضيب تقليب ، سخني الدورق حتى يذوب الاغاروز تماما في المخزن المؤقت ويغلي المحلول ويتحول إلى صفوف. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام فرن الميكروويف عن طريق وضع الدورق في الفرن والتسخين لمدة 30 ثانية ، باستخدام قضيب تقليب للخلط كل 10 ثوان ، وكرر ذلك حتى يغلي الخليط ويتحول إلى صفاء.
- اقلب قارورة Erlenmeyer سعة 50 مل في فتحة القارورة سعة 250 مل لتكون بمثابة ارتجاع ، مما يمنع محلول الاغاروز من التبخر.
- اترك محلول الاغاروز يبرد إلى 60 درجة مئوية ، واسكب 30-50 مل في كل صينية جل مسجلة.
- ضع مشط جل في الزوج الأول من الشقوق لإنشاء آبار هلامية.
- اترك الجل يبرد تماما قبل إزالة الشريط والمشط. سوف يتجمد الجل ويتحول من صاف إلى غائم عندما يصبح جاهزا ، حوالي 10-20 دقيقة.
- ضع جل الاغاروز المصنوع مسبقا بنسبة 3٪ على صينية هلام أو استخدم صينية جل تم استخدامها لصب جل الاغاروز المصبوب .
- حرك صينية الجل في غرفة الرحلان الكهربائي مع الآبار الأقرب إلى نهاية الكاثود (الأسود).
- صب 1x عازلة TAE في الغرفة ، وهو ما يكفي للحصول على 2 مم من المخزن المؤقت فوق الجزء العلوي من صينية الجل.
- احصل على أنابيب PCR من جهاز التدوير الحراري وضعها في حامل الأنابيب الدقيقة.
- باستخدام طرف ماصة جديد في كل مرة، أضف 10 ميكرولتر من صبغة التحميل البرتقالية G المشتراة (LD) إلى كل عينة واخلطها جيدا.
- قم بتحميل 20 ميكرولتر من مسطرة الوزن الجزيئي و 20 ميكرولتر من كل عينة في الجل بالترتيب الموضح (الجدول 2).
- قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام لمدة 30 دقيقة عند 100 فولت.
- قم بإزالة صينية الجل من الحجرة وحرك الجل لإزالته من الصينية. ضع الجل في صينية تلطيخ.
- اغمر الجل في صبغة هلام الحمض النووي المشتراة لمدة 5 دقائق ، مع رج الصينية بعناية للمساعدة في توزيع البقعة في جميع أنحاء الجل.
- انقل الجل إلى وعاء الغسيل واشطفه بماء الصنبور (40-55 درجة مئوية) لمدة 10 ثوان تقريبا.
- قم بغسل 3 مرات في ماء الصنبور الدافئ لمدة 6 دقائق مع رج لطيف للحصول على أفضل النتائج. إذا لزم الأمر ، استمر في البقع بالماء الدافئ حتى يتم الوصول إلى التباين المطلوب.
الأطعمة المعدلة وراثيا هي المنتجات التي تحتوي على مكون أو مكونات تم تغيير الحمض النووي الخاص بها على وجه التحديد. يمكن الكشف عن وجود هذه التعديلات باستخدام تقنية تسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل.
كان التعديل الجيني للأطعمة قضية مثيرة للجدل بسبب المخاوف الجديرة بشأن الصحة والسلامة البيئية. تسمح القدرة على اكتشاف الحمض النووي المعدل وراثيا في عينات الأغذية ذات الأهمية باتخاذ قرارات مستنيرة بشأن السلامة والمخاطر المحتملة لاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا ، أو الكائنات المعدلة وراثيا ، في الإمدادات الغذائية.
يستخدمتفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لتضخيم الحمض النووي للأغذية لتحديد وجود أو عدم وجود تسلسلات معدلة وراثيا. ثم يسحب الرحلان الكهربائي للهلام الحمض النووي المضخم من خلال مصفوفة هلام الاغاروز ويفصل نطاقات الحمض النووي بأحجام مختلفة تتوافق مع العلامات المعدلة أو غير المعدلة. ثم تتم مقارنتها بنطاقات التحكم من الأطعمة المعروفة باحتوائها على الكائنات المعدلة وراثيا ، أو المعروفة بأنها خالية من التعديل.
سيوضح هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء اكتشاف الحمض النووي المعدل وراثيا من عينات الأغذية ، وكيفية استخراج الحمض النووي وتضخيم العلامات المستخدمة في عملية التعديل الجيني ، وكيف يمكن إثبات وجود أو عدم وجود الكائنات المعدلة وراثيا في عينات الأغذية.
يحدد تفاعل البوليميراز المتسلسل تسلسل تسلسل الحمض النووي الذي تم إدخاله في الطعام المعدل وراثيا. الحمض النووي هو جزيء مستقر نسبيا ، لذلك يمكن عزل شظايا الحمض النووي القابلة للحياة المناسبة للتضخيم حتى من السلع عالية المعالجة ، مثل رقائق الذرة أو برغر الخضار.
يتم استخدام عدد صغير من تسلسلات الحمض النووي التنظيمية للتحكم في التعبير عن الجينات المدرجة ، وبالتالي فإن هذه التسلسلات موجودة في غالبية المحاصيل المعدلة وراثيا. يحدد هذا الإجراء اثنين من أكثر الجين استخداما ، وهما جين المحفز 35S وجين فاصل سينسيز نوبالين. يعد تسلسل 35S محفزا قويا ، وعند توصيله بجين تم إدخاله ، سيؤدي إلى مستويات ثابتة وعالية من التعبير. يتم تضمين فاصل سينسيز نوبالين لإيقاف نسخ الجين المدرج عند نقطة النهاية المطلوبة.
يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل دورات تسخين وتبريد متكررة في جهاز تدوير حراري ، وهو جهاز يتحكم بإحكام في درجة حرارة أنابيب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يؤدي تسخين العينة إلى 94 درجة مئوية إلى تشويه خيوط الحمض النووي وانفصالها. التبريد السريع إلى ما بين 45 و 65 °C يسمح للبادئات بالتلدين بخيوط الحمض النووي المنفصلة. أخيرا ، إعادة التسخين إلى 72 ° C يسمح لإنزيم Taq polymerase بتمديد الاشعال والتكرار الكامل للمنطقة المستهدفة.
يضاف التمهيدي النباتي الذي تم شراؤه إلى كل عينة ، وسوف يتضخم في العينات التي تحتوي على الحمض النووي للنبات. تستخدم القوالب الإيجابية للكائنات المعدلة وراثيا ل 35S و NOS لتوفير تحكم إيجابي للكائنات المعدلة وراثيا. يتم استخدام مادة معتمدة غير معدلة وراثيا كعنصر تحكم سلبي. إذا أظهر أي من تفاعلات التحكم هذه نطاقات غير متوقعة ، فلا يمكن الوثوق بنتائج عينات الاختبار.
يتم تشغيل الحمض النووي المضخم من خلال هلام الاغاروز عن طريق الرحلان الكهربائي. يتم خلط منتجات PCR مع صبغة وتحميلها في الآبار. الحمض النووي مشحون سالبا ، وعند تحميله في الجل في نهاية الكاثود من الغرفة ، سيتحرك نحو نهاية الأنود عند تطبيق التيار. لا يمكن لشظايا الحمض النووي الأكبر أن تتحرك بسهولة عبر مصفوفة الهلام ، لذا ستبقى أقرب إلى الكاثود ، بينما تتحرك التسلسلات الأصغر نحو نهاية الأنود ، مما يؤدي إلى فصل الحمض النووي بأحجام مختلفة إلى نطاقات متميزة.
بعد الرحلان الكهربائي ، يساعد تلطيخ الجل على تصور عصابات الحمض النووي المنفصلة.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمبادئ الكامنة وراء الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا واستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي لتحديد الكائنات المعدلة وراثيا ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذ ذلك في المختبر.
بمجرد تحديد المنتجات الغذائية ذات الأهمية ، يمكن أن يبدأ التحليل. لاستخراج الحمض النووي ، خذ أنبوبين نظيفين من الغطاء اللولبي ، وإلى كل منهما انقل 500 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الذي تم شراؤه ، مع التأكد من ماصة المزيج لأعلى ولأسفل بين الحصص لخلط الكاشف بالتساوي. قم بتسمية أحد الأنابيب بأنه "غير معدل وراثيا" ، والآخر "اختبار".
بعد ذلك ، قم بوزن 0.5 جرام من الأطعمة المعتمدة غير المعدلة وراثيا ، وضعها في هاون نظيف. أضف 2.5 مل من الماء المقطر ، وطحنها بالمدقة لمدة دقيقتين لتشكيل ملاط. أضف 2.5 مل أخرى من الماء المقطر واستمر في طحن الملاط حتى يصبح ناعما بدرجة كافية للماصة.
الماصة 50 ميكرولتر من الملاط المعروف غير المعدل وراثيا إلى أنبوب الغطاء اللولبي المسمى "غير المعدلة وراثيا" الذي يحتوي على كاشف عزل الحمض النووي. أضف الآن 50 ميكرولتر من ملاط عينة طعام الاختبار إلى أنبوب الغطاء اللولبي الذي يحمل علامة "اختبار". دوامة الأنبوبين اللذين يحتويان على عينات الطعام وكاشف الحمض النووي لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في حمام مائي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أخيرا ، ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق. عند الفحص ، يجب تشكيل حبيبات صلبة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم تشكيل الحبيبات بعد 5 دقائق, جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقتين حتى تتشكل الحبيبات. يمكن الآن استخدام العينات على الفور لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
أولا ، عدد ستة أنابيب PCR. تتوافق هذه الأرقام مع محتويات الأنبوب المدرجة في الجدول. ضع كل أنبوب من أنابيب PCR المسمى في حامل أنبوب دقيق مع أغطية مفتوحة.
باستخدام طرف جديد لكل إضافة ، أضف 20 ميكرولتر أولي موضح في الجدول إلى كل أنبوب PCR. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر من عينات الحمض النووي الموضحة في الجدول إلى كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الماصة لأعلى ولأسفل للخلط. بالنسبة للعينات المحببة ، تأكد من الماصة فقط من المادة الطافية ، وتجنب الحبيبات الصلبة في قاع الأنابيب. أخيرا ، ضع أنابيب PCR في جهاز تدوير حراري وقم ببرمجتها للتنقل عبر خطوات التسخين والتبريد الموضحة في الجدول.
ضع هلام الاغاروز بنسبة 3٪ في غرفة الرحلان الكهربائي مع الآبار الأقرب إلى نهاية الكاثود. أضف المخزن المؤقت TAE إلى الغرفة لتغطية 2 مم فوق صينية الجل. اجمع أنابيب PCR من جهاز التدوير الحراري وضعها في حامل الأنابيب الدقيقة. باستخدام طرف ماصة جديد في كل مرة، أضف 10 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي المشتراة إلى كل عينة واخلطها جيدا.
باستخدام طرف جديد في كل مرة ، قم بتحميل آبار هلام الاغاروز ب 20 ميكرولتر من مسطرة الوزن الجزيئي في بئر واحد ، و 20 ميكرولتر من كل عينة في آبار لاحقة ، كما هو موضح في هذا الجدول. اضبط حجرة الرحلان الكهربائي لتعمل على 100 فولت لمدة 30 دقيقة.
بمجرد انتهاء تشغيل الجل ، افصل حجرة الجل بعناية ، وقم بإزالة الدرج ، وحرك الجل في صينية تلطيخ. اغمر الجل في صبغة جل 100x المشتراة لمدة 5 دقائق مع رج الدرج برفق لتوزيع البقعة. بمجرد تلطيخها ، انقل الجل إلى وعاء غسيل واشطفه بماء الصنبور لمدة 10 ثوان تقريبا. قم بغسلها عن طريق الغسيل ثلاث مرات بماء الصنبور الدافئ لمدة 3 دقائق لكل منها ، مع رج برفق للحصول على أفضل النتائج. إذا لزم الأمر ، استمر في البقع بالماء الدافئ حتى يتم الوصول إلى التباين المطلوب.
وجود أو عدم وجود نطاق 200 نقطة أساس في الممر 4 إلى ما إذا كان طعام الاختبار يحتوي على كائنات معدلة وراثيا. تحدد الاشعال النباتية ما إذا كان قد تم استخراج الحمض النووي للنبات بنجاح من العينة. يعد التحكم في الأغذية غير المعدلة وراثيا مؤشرا على النتائج الإيجابية الخاطئة ، في حالة حدوثها. إذا كانت مراقبة الأغذية غير المعدلة وراثيا إيجابية ، فهذا يعني أن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ملوثا في مرحلة ما. يعد عنصر التحكم في القالب الإيجابي للمعدل المعدلة وراثيا مؤشرا على السلبيات الخاطئة. إذا لم يتم تضخيم عنصر التحكم في القالب الإيجابي للكائنات المعدلة وراثيا ، فهناك مشكلة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ولا يمكن الوثوق بنتيجة سلبية للكائنات المعدلة وراثيا من طعام الاختبار.
يمكن وضع المواد الهلامية على ورق أبيض أو أصفر لتوفير خلفية متباينة لتسليط الضوء على نطاقات الحمض النووي ، أو يمكن تحقيق زيادة التباين باستخدام صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
إن القدرة على اختبار المواد الغذائية أو المنتجات بحثا عن مكونات معدلة وراثيا ذات صلة بعدد من التطبيقات العلمية أو التنظيمية.
هناك بعض الأدلة على أن الحمض النووي المعدل وراثيا من المحاصيل المعدلة وراثيا يمكن أن يدخل في جينومات مجموعات المحاصيل البرية. على سبيل المثال ، قد تسهل الملقحات هذا النقل عن طريق تسميد النباتات البرية بحبوب اللقاح من مصدر معدل وراثيا. هذا مصدر قلق ، لأن آثار انتشار هذه الجينات المدخلة على النظم البيئية ككل ليست مفهومة جيدا. يمكن أن يوفر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للمجموعات البرية بيانات عن الانتشار المحتمل ، أو الاحتواء الناجح ، للإدخالات الجينية.
يمكن أن يكون عدم وجود الملصقات أو وضع العلامات غير الصحيحة على المكونات المعدلة وراثيا مصدر قلق للمستهلكين. قد يكون هذا بسبب تفضيل المستهلك للاستهلاك ، أو الإدخال المحتمل لمسببات الحساسية أثناء عملية التعديل المعدلة وراثيا ، على الرغم من أن هذا الأخير مثير للجدل. في بعض البلدان ، يلزم إدراج المكونات المعدلة وراثيا على عبوات المواد الغذائية. قد تستخدم المجالس التنظيمية في هذه البلدان اختبار PCR للتحقق من دقة وضع العلامات على الأغذية.
عندما يمنح التعديل الجيني الذي يتم إدخاله إلى المحصول مقاومة لمبيدات الآفات ، أثارت بعض الدراسات مخاوف بشأن إنتاج "الحشائش الفائقة". بشكل أساسي ، يمكن أن تكون هذه أي نبات لم يتم استهدافه في البداية للتعديل الذي يحصل على مقاومة المبيدات الحشرية من خلال آليات مثل الإدخال أو التهجين. قد تكون هذه النباتات قادرة بعد ذلك على الانتشار بشكل أكثر نجاحا ، ويكون من الصعب التحكم فيها أكثر من تلك التي لا تحتوي على الإدخال. يمكن أن يساعد اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للتعديل الجيني في تسليط الضوء على هذه المجموعات السكانية المحتملة وتتبعها لتحديد ما إذا كان هذا الانتشار يمكن أن يكون مشكلة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاختبار الأطعمة المعدلة وراثيا. يجب أن تفهم الآن المبادئ الكامنة وراء تحديد الأطعمة المعدلة وراثيا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وكيفية استخراج الحمض النووي وتضخيمه من الطعام ، وكيفية تحديد ما إذا كانت عينة طعامك قد تم تعديلها وراثيا. شكرا للمشاهدة!
المصدر: مختبرات مارغريت وركمان وكيمبرلي فراي - جامعة ديبول
كان التعديل الجيني للأطعمة قضية مثيرة للجدل بسبب المخاوف الجديرة بشأن الصحة والسلامة البيئية. توضح هذه التجربة الفهم التقني لكيفية تحديد الحمض النووي للأغذية وراثيا ، مما يسمح باتخاذ قرارات مستنيرة بشأن السلامة والمخاطر المحتملة لاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا (GMOs) في الإمدادات الغذائية.
يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي للأغذية لاختبار وجود الحمض النووي المعدل وراثيا في المنتجات الغذائية. يتم الكشف عن وجود نطاقات محددة من الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام لسحب الحمض النووي للأغذية المستخرج من خلال هلام الاغاروز بنسبة 3٪ ، وهو تركيز كثيف بما يكفي لفصل نطاقات الحمض النووي التي تحتوي على الحمض النووي المعدل وراثيا. يتم استخدام العديد من الضوابط في إجراء الرحلان الكهربائي لضمان استخراج الحمض النووي بنجاح من أطعمة الاختبار (التمهيدي النباتي) ، ولتقديم أمثلة معروفة لكل من الحمض النووي المعدل وراثيا (الحمض النووي المعدل وراثيا المشترا) والحمض النووي غير المعدل وراثيا (تم شراؤه للتحكم في الأغذية غير المعدلة وراثيا).
- أضف 500 ميكرولتر من مصفوفة مزيج PCR المشتراة إلى كل من أنبوبي الغطاء اللولبي 2 باستخدام ماصة نقل أو ماصة دقيقة قابلة للتعديل 200-1,000 ميكرولتر. الماصة لأعلى ولأسفل مع الماصة بين كل حصة لخلط مصفوفة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتساوي.
- قم بتسمية أنبوب الغطاء اللولبي "غير معدل وراثيا" والآخر "اختبار".
- قم بوزن 0.5 جرام من الطعام المعتمد غير المعدل وراثيا وضعه في الهاون.
- أضف 2.5 مل من الماء المقطر وطحنها بالمدقة لمدة دقيقتين لتشكيل ملاط.
- أضف 2.5 مل أخرى من الماء المقطر واستمر في الطحن بالمدقة حتى يصبح الملاط ناعما بدرجة كافية لسحب الماصة.
- Pipet 50 ميكرولتر من الملاط المطحون إلى أنبوب الغطاء اللولبي الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من الخلطة الجاهزة PCR المسماة "غير المعدلة وراثيا" باستخدام علامة 50 ميكرولتر على ماصة متدرجة. أنبوب الملخص.
- كرر الخطوات 1.3-1.6 لتحضير عينة طعام الاختبار.
- Pipet 50 ميكرولتر من ملاط طعام الاختبار الأرضي إلى أنبوب الغطاء اللولبي المسمى "اختبار". أنبوب الملخص.
- دوامة الطعام غير المعدلة وراثيا واختبار أنابيب PCR للأغذية لمدة 1 دقيقة ووضع الأنابيب في حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إذا لم تكن الدوامة متوفرة ، فقم بنفض الغبار عن الأنبوب عدة مرات للخلط قبل وضعه في حمام مائي.
- ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق. يجب أن تتشكل حبيبات صلبة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم تشكيل الحبيبات بعد 5 دقائق, جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 2 دقيقة حتى تتشكل الحبيبات.
- يمكن استخدام الأنابيب على الفور لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. إعداد تفاعلات PCR
- عدد أنابيب PCR 1-6 وأولية لهم. يجب أن تتوافق الأرقام مع محتويات الأنبوب التالية المدرجة في الجدول 1.
- ضع كل أنبوب PCR مسمى في حامل أنبوب دقيق مع أغطية مفتوحة.
- باستخدام طرف جديد لكل إضافة ، أضف 20 ميكرولتر من التمهيدي الموضح في الجدول 1 إلى كل أنبوب PCR. أنابيب الغطاء.
- باستخدام طرف جديد لكل أنبوب ، أضف 20 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الموضحة في الجدول 1 إلى كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع التأكد من الماصة فقط من المادة الطافية وتجنب الحبيبات الصلبة في قاع الأنابيب.
- بعد سحب كل عينة من عينة الحمض النووي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابل، استخدم الماصة لخلط الحمض النووي والبرايمر عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل؛ تلخيص الأنابيب.
- ضع أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري وقم ببرمجة جهاز التدوير من أجل:
التغيير الطبيعي الأولي: دورة واحدة عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين < br / > التضخيم: 40 دورة عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة (التنويذة) ، و 59 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة (التلدين) ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين (تمديد).
التمديد النهائي: دورة واحدة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق < / > الانتظار: 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
3. 3٪ تحضير جل الاغاروز
- باستخدام شريط لاصق أو لاصق ، قم بلصق الأطراف المفتوحة لصينية الجل بإحكام. تأكد من إغلاق الشريط على حواف الدرج لمنع تسرب الاغاروز المنصهر.
- قم بوزن 3 جم من الاغاروز في قارورة إرلينماير سعة 250 مل أو أكبر.
- أضف 100 مل من 1x TAE المؤقت (تم شراؤه أو تحضيره من المركز).
- باستخدام لوح تسخين مغناطيسي مع قضيب تقليب ، سخني الدورق حتى يذوب الاغاروز تماما في المخزن المؤقت ويغلي المحلول ويتحول إلى صفوف. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام فرن الميكروويف عن طريق وضع الدورق في الفرن والتسخين لمدة 30 ثانية ، باستخدام قضيب تقليب للخلط كل 10 ثوان ، وكرر ذلك حتى يغلي الخليط ويتحول إلى صفاء.
- اقلب قارورة Erlenmeyer سعة 50 مل في فتحة القارورة سعة 250 مل لتكون بمثابة ارتجاع ، مما يمنع محلول الاغاروز من التبخر.
- اترك محلول الاغاروز يبرد إلى 60 درجة مئوية ، واسكب 30-50 مل في كل صينية جل مسجلة.
- ضع مشط جل في الزوج الأول من الشقوق لإنشاء آبار هلامية.
- اترك الجل يبرد تماما قبل إزالة الشريط والمشط. سوف يتجمد الجل ويتحول من صاف إلى غائم عندما يصبح جاهزا ، حوالي 10-20 دقيقة.
- ضع جل الاغاروز المصنوع مسبقا بنسبة 3٪ على صينية هلام أو استخدم صينية جل تم استخدامها لصب جل الاغاروز المصبوب .
- حرك صينية الجل في غرفة الرحلان الكهربائي مع الآبار الأقرب إلى نهاية الكاثود (الأسود).
- صب 1x عازلة TAE في الغرفة ، وهو ما يكفي للحصول على 2 مم من المخزن المؤقت فوق الجزء العلوي من صينية الجل.
- احصل على أنابيب PCR من جهاز التدوير الحراري وضعها في حامل الأنابيب الدقيقة.
- باستخدام طرف ماصة جديد في كل مرة، أضف 10 ميكرولتر من صبغة التحميل البرتقالية G المشتراة (LD) إلى كل عينة واخلطها جيدا.
- قم بتحميل 20 ميكرولتر من مسطرة الوزن الجزيئي و 20 ميكرولتر من كل عينة في الجل بالترتيب الموضح (الجدول 2).
- قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام لمدة 30 دقيقة عند 100 فولت.
- قم بإزالة صينية الجل من الحجرة وحرك الجل لإزالته من الصينية. ضع الجل في صينية تلطيخ.
- اغمر الجل في صبغة هلام الحمض النووي المشتراة لمدة 5 دقائق ، مع رج الصينية بعناية للمساعدة في توزيع البقعة في جميع أنحاء الجل.
- انقل الجل إلى وعاء الغسيل واشطفه بماء الصنبور (40-55 درجة مئوية) لمدة 10 ثوان تقريبا.
- قم بغسل 3 مرات في ماء الصنبور الدافئ لمدة 6 دقائق مع رج لطيف للحصول على أفضل النتائج. إذا لزم الأمر ، استمر في البقع بالماء الدافئ حتى يتم الوصول إلى التباين المطلوب.
الأطعمة المعدلة وراثيا هي المنتجات التي تحتوي على مكون أو مكونات تم تغيير الحمض النووي الخاص بها على وجه التحديد. يمكن الكشف عن وجود هذه التعديلات باستخدام تقنية تسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل.
كان التعديل الجيني للأطعمة قضية مثيرة للجدل بسبب المخاوف الجديرة بشأن الصحة والسلامة البيئية. تسمح القدرة على اكتشاف الحمض النووي المعدل وراثيا في عينات الأغذية ذات الأهمية باتخاذ قرارات مستنيرة بشأن السلامة والمخاطر المحتملة لاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا ، أو الكائنات المعدلة وراثيا ، في الإمدادات الغذائية.
يستخدمتفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لتضخيم الحمض النووي للأغذية لتحديد وجود أو عدم وجود تسلسلات معدلة وراثيا. ثم يسحب الرحلان الكهربائي للهلام الحمض النووي المضخم من خلال مصفوفة هلام الاغاروز ويفصل نطاقات الحمض النووي بأحجام مختلفة تتوافق مع العلامات المعدلة أو غير المعدلة. ثم تتم مقارنتها بنطاقات التحكم من الأطعمة المعروفة باحتوائها على الكائنات المعدلة وراثيا ، أو المعروفة بأنها خالية من التعديل.
سيوضح هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء اكتشاف الحمض النووي المعدل وراثيا من عينات الأغذية ، وكيفية استخراج الحمض النووي وتضخيم العلامات المستخدمة في عملية التعديل الجيني ، وكيف يمكن إثبات وجود أو عدم وجود الكائنات المعدلة وراثيا في عينات الأغذية.
يحدد تفاعل البوليميراز المتسلسل تسلسل تسلسل الحمض النووي الذي تم إدخاله في الطعام المعدل وراثيا. الحمض النووي هو جزيء مستقر نسبيا ، لذلك يمكن عزل شظايا الحمض النووي القابلة للحياة المناسبة للتضخيم حتى من السلع عالية المعالجة ، مثل رقائق الذرة أو برغر الخضار.
يتم استخدام عدد صغير من تسلسلات الحمض النووي التنظيمية للتحكم في التعبير عن الجينات المدرجة ، وبالتالي فإن هذه التسلسلات موجودة في غالبية المحاصيل المعدلة وراثيا. يحدد هذا الإجراء اثنين من أكثر الجين استخداما ، وهما جين المحفز 35S وجين فاصل سينسيز نوبالين. يعد تسلسل 35S محفزا قويا ، وعند توصيله بجين تم إدخاله ، سيؤدي إلى مستويات ثابتة وعالية من التعبير. يتم تضمين فاصل سينسيز نوبالين لإيقاف نسخ الجين المدرج عند نقطة النهاية المطلوبة.
يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل دورات تسخين وتبريد متكررة في جهاز تدوير حراري ، وهو جهاز يتحكم بإحكام في درجة حرارة أنابيب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يؤدي تسخين العينة إلى 94 درجة مئوية إلى تشويه خيوط الحمض النووي وانفصالها. التبريد السريع إلى ما بين 45 و 65 °C يسمح للبادئات بالتلدين بخيوط الحمض النووي المنفصلة. أخيرا ، إعادة التسخين إلى 72 ° C يسمح لإنزيم Taq polymerase بتمديد الاشعال والتكرار الكامل للمنطقة المستهدفة.
يضاف التمهيدي النباتي الذي تم شراؤه إلى كل عينة ، وسوف يتضخم في العينات التي تحتوي على الحمض النووي للنبات. تستخدم القوالب الإيجابية للكائنات المعدلة وراثيا ل 35S و NOS لتوفير تحكم إيجابي للكائنات المعدلة وراثيا. يتم استخدام مادة معتمدة غير معدلة وراثيا كعنصر تحكم سلبي. إذا أظهر أي من تفاعلات التحكم هذه نطاقات غير متوقعة ، فلا يمكن الوثوق بنتائج عينات الاختبار.
يتم تشغيل الحمض النووي المضخم من خلال هلام الاغاروز عن طريق الرحلان الكهربائي. يتم خلط منتجات PCR مع صبغة وتحميلها في الآبار. الحمض النووي مشحون سالبا ، وعند تحميله في الجل في نهاية الكاثود من الغرفة ، سيتحرك نحو نهاية الأنود عند تطبيق التيار. لا يمكن لشظايا الحمض النووي الأكبر أن تتحرك بسهولة عبر مصفوفة الهلام ، لذا ستبقى أقرب إلى الكاثود ، بينما تتحرك التسلسلات الأصغر نحو نهاية الأنود ، مما يؤدي إلى فصل الحمض النووي بأحجام مختلفة إلى نطاقات متميزة.
بعد الرحلان الكهربائي ، يساعد تلطيخ الجل على تصور عصابات الحمض النووي المنفصلة.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمبادئ الكامنة وراء الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا واستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي لتحديد الكائنات المعدلة وراثيا ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذ ذلك في المختبر.
بمجرد تحديد المنتجات الغذائية ذات الأهمية ، يمكن أن يبدأ التحليل. لاستخراج الحمض النووي ، خذ أنبوبين نظيفين من الغطاء اللولبي ، وإلى كل منهما انقل 500 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الذي تم شراؤه ، مع التأكد من ماصة المزيج لأعلى ولأسفل بين الحصص لخلط الكاشف بالتساوي. قم بتسمية أحد الأنابيب بأنه "غير معدل وراثيا" ، والآخر "اختبار".
بعد ذلك ، قم بوزن 0.5 جرام من الأطعمة المعتمدة غير المعدلة وراثيا ، وضعها في هاون نظيف. أضف 2.5 مل من الماء المقطر ، وطحنها بالمدقة لمدة دقيقتين لتشكيل ملاط. أضف 2.5 مل أخرى من الماء المقطر واستمر في طحن الملاط حتى يصبح ناعما بدرجة كافية للماصة.
الماصة 50 ميكرولتر من الملاط المعروف غير المعدل وراثيا إلى أنبوب الغطاء اللولبي المسمى "غير المعدلة وراثيا" الذي يحتوي على كاشف عزل الحمض النووي. أضف الآن 50 ميكرولتر من ملاط عينة طعام الاختبار إلى أنبوب الغطاء اللولبي الذي يحمل علامة "اختبار". دوامة الأنبوبين اللذين يحتويان على عينات الطعام وكاشف الحمض النووي لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في حمام مائي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أخيرا ، ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق. عند الفحص ، يجب تشكيل حبيبات صلبة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم تشكيل الحبيبات بعد 5 دقائق, جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقتين حتى تتشكل الحبيبات. يمكن الآن استخدام العينات على الفور لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
أولا ، عدد ستة أنابيب PCR. تتوافق هذه الأرقام مع محتويات الأنبوب المدرجة في الجدول. ضع كل أنبوب من أنابيب PCR المسمى في حامل أنبوب دقيق مع أغطية مفتوحة.
باستخدام طرف جديد لكل إضافة ، أضف 20 ميكرولتر أولي موضح في الجدول إلى كل أنبوب PCR. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر من عينات الحمض النووي الموضحة في الجدول إلى كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الماصة لأعلى ولأسفل للخلط. بالنسبة للعينات المحببة ، تأكد من الماصة فقط من المادة الطافية ، وتجنب الحبيبات الصلبة في قاع الأنابيب. أخيرا ، ضع أنابيب PCR في جهاز تدوير حراري وقم ببرمجتها للتنقل عبر خطوات التسخين والتبريد الموضحة في الجدول.
ضع هلام الاغاروز بنسبة 3٪ في غرفة الرحلان الكهربائي مع الآبار الأقرب إلى نهاية الكاثود. أضف المخزن المؤقت TAE إلى الغرفة لتغطية 2 مم فوق صينية الجل. اجمع أنابيب PCR من جهاز التدوير الحراري وضعها في حامل الأنابيب الدقيقة. باستخدام طرف ماصة جديد في كل مرة، أضف 10 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي المشتراة إلى كل عينة واخلطها جيدا.
باستخدام طرف جديد في كل مرة ، قم بتحميل آبار هلام الاغاروز ب 20 ميكرولتر من مسطرة الوزن الجزيئي في بئر واحد ، و 20 ميكرولتر من كل عينة في آبار لاحقة ، كما هو موضح في هذا الجدول. اضبط حجرة الرحلان الكهربائي لتعمل على 100 فولت لمدة 30 دقيقة.
بمجرد انتهاء تشغيل الجل ، افصل حجرة الجل بعناية ، وقم بإزالة الدرج ، وحرك الجل في صينية تلطيخ. اغمر الجل في صبغة جل 100x المشتراة لمدة 5 دقائق مع رج الدرج برفق لتوزيع البقعة. بمجرد تلطيخها ، انقل الجل إلى وعاء غسيل واشطفه بماء الصنبور لمدة 10 ثوان تقريبا. قم بغسلها عن طريق الغسيل ثلاث مرات بماء الصنبور الدافئ لمدة 3 دقائق لكل منها ، مع رج برفق للحصول على أفضل النتائج. إذا لزم الأمر ، استمر في البقع بالماء الدافئ حتى يتم الوصول إلى التباين المطلوب.
وجود أو عدم وجود نطاق 200 نقطة أساس في الممر 4 إلى ما إذا كان طعام الاختبار يحتوي على كائنات معدلة وراثيا. تحدد الاشعال النباتية ما إذا كان قد تم استخراج الحمض النووي للنبات بنجاح من العينة. يعد التحكم في الأغذية غير المعدلة وراثيا مؤشرا على النتائج الإيجابية الخاطئة ، في حالة حدوثها. إذا كانت مراقبة الأغذية غير المعدلة وراثيا إيجابية ، فهذا يعني أن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ملوثا في مرحلة ما. يعد عنصر التحكم في القالب الإيجابي للمعدل المعدلة وراثيا مؤشرا على السلبيات الخاطئة. إذا لم يتم تضخيم عنصر التحكم في القالب الإيجابي للكائنات المعدلة وراثيا ، فهناك مشكلة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ولا يمكن الوثوق بنتيجة سلبية للكائنات المعدلة وراثيا من طعام الاختبار.
يمكن وضع المواد الهلامية على ورق أبيض أو أصفر لتوفير خلفية متباينة لتسليط الضوء على نطاقات الحمض النووي ، أو يمكن تحقيق زيادة التباين باستخدام صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
إن القدرة على اختبار المواد الغذائية أو المنتجات بحثا عن مكونات معدلة وراثيا ذات صلة بعدد من التطبيقات العلمية أو التنظيمية.
هناك بعض الأدلة على أن الحمض النووي المعدل وراثيا من المحاصيل المعدلة وراثيا يمكن أن يدخل في جينومات مجموعات المحاصيل البرية. على سبيل المثال ، قد تسهل الملقحات هذا النقل عن طريق تسميد النباتات البرية بحبوب اللقاح من مصدر معدل وراثيا. هذا مصدر قلق ، لأن آثار انتشار هذه الجينات المدخلة على النظم البيئية ككل ليست مفهومة جيدا. يمكن أن يوفر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للمجموعات البرية بيانات عن الانتشار المحتمل ، أو الاحتواء الناجح ، للإدخالات الجينية.
يمكن أن يكون عدم وجود الملصقات أو وضع العلامات غير الصحيحة على المكونات المعدلة وراثيا مصدر قلق للمستهلكين. قد يكون هذا بسبب تفضيل المستهلك للاستهلاك ، أو الإدخال المحتمل لمسببات الحساسية أثناء عملية التعديل المعدلة وراثيا ، على الرغم من أن هذا الأخير مثير للجدل. في بعض البلدان ، يلزم إدراج المكونات المعدلة وراثيا على عبوات المواد الغذائية. قد تستخدم المجالس التنظيمية في هذه البلدان اختبار PCR للتحقق من دقة وضع العلامات على الأغذية.
عندما يمنح التعديل الجيني الذي يتم إدخاله إلى المحصول مقاومة لمبيدات الآفات ، أثارت بعض الدراسات مخاوف بشأن إنتاج "الحشائش الفائقة". بشكل أساسي ، يمكن أن تكون هذه أي نبات لم يتم استهدافه في البداية للتعديل الذي يحصل على مقاومة المبيدات الحشرية من خلال آليات مثل الإدخال أو التهجين. قد تكون هذه النباتات قادرة بعد ذلك على الانتشار بشكل أكثر نجاحا ، ويكون من الصعب التحكم فيها أكثر من تلك التي لا تحتوي على الإدخال. يمكن أن يساعد اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للتعديل الجيني في تسليط الضوء على هذه المجموعات السكانية المحتملة وتتبعها لتحديد ما إذا كان هذا الانتشار يمكن أن يكون مشكلة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاختبار الأطعمة المعدلة وراثيا. يجب أن تفهم الآن المبادئ الكامنة وراء تحديد الأطعمة المعدلة وراثيا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وكيفية استخراج الحمض النووي وتضخيمه من الطعام ، وكيفية تحديد ما إذا كانت عينة طعامك قد تم تعديلها وراثيا. شكرا للمشاهدة!
الأطعمة المعدلة وراثيا هي المنتجات التي تحتوي على مكون أو مكونات تم تغيير الحمض النووي الخاص بها على وجه التحديد. يمكن الكشف عن وجود هذه التعديلات باستخدام تقنية تسمى تفاعل البوليميراز المتسلسل.
كان التعديل الجيني للأطعمة قضية مثيرة للجدل بسبب المخاوف الجديرة بشأن الصحة والسلامة البيئية. تسمح القدرة على اكتشاف الحمض النووي المعدل وراثيا في عينات الأغذية ذات الأهمية باتخاذ قرارات مستنيرة بشأن السلامة والمخاطر المحتملة لاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا ، أو الكائنات المعدلة وراثيا ، في الإمدادات الغذائية.
يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لتضخيم الحمض النووي للأغذية لتحديد وجود أو عدم وجود تسلسلات معدلة وراثيا. ثم يسحب الرحلان الكهربائي للهلام الحمض النووي المضخم من خلال مصفوفة هلام الاغاروز ويفصل نطاقات الحمض النووي بأحجام مختلفة تتوافق مع العلامات المعدلة أو غير المعدلة. ثم تتم مقارنتها بنطاقات التحكم من الأطعمة المعروفة باحتوائها على الكائنات المعدلة وراثيا ، أو المعروفة بأنها خالية من التعديل.
سيوضح هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء اكتشاف الحمض النووي المعدل وراثيا من عينات الأغذية ، وكيفية استخراج الحمض النووي وتضخيم العلامات المستخدمة في عملية التعديل الجيني ، وكيف يمكن إثبات وجود أو عدم وجود الكائنات المعدلة وراثيا في عينات الأغذية.
يحدد تفاعل البوليميراز المتسلسل تسلسل تسلسل الحمض النووي الذي تم إدخاله في الطعام المعدل وراثيا. الحمض النووي هو جزيء مستقر نسبيا ، لذلك يمكن عزل شظايا الحمض النووي القابلة للحياة المناسبة للتضخيم حتى من السلع عالية المعالجة ، مثل رقائق الذرة أو برغر الخضار. يتم استخدام عدد صغير من تسلسلات الحمض النووي التنظيمية للتحكم في التعبير عن الجينات المدرجة ، وبالتالي فإن هذه التسلسلات موجودة في غالبية المحاصيل المعدلة وراثيا. يحدد هذا الإجراء اثنين من أكثر الجين استخداما ، وهما جين المحفز 35S وجين فاصل سينسيز نوبالين. التسلسل 35S هو محفز قوي ، وعندما يرتبط بجين مدرج سيؤدي إلى مستويات ثابتة وعالية من التعبير. يتم تضمين فاصل سينسيز نوبالين لإيقاف نسخ الجين المدرج عند نقطة النهاية المطلوبة.
يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل دورات تسخين وتبريد متكررة في جهاز تدوير حراري ، وهو جهاز يتحكم بإحكام في درجة حرارة أنابيب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تسخين العينة إلى 94؟ يتسبب C في تشويه خيوط الحمض النووي وانفصالها. تبريد سريع إلى ما بين 45 و 65؟ يسمح C للبادئات بالتلدين بخيوط الحمض النووي المنفصلة. أخيرا ، إعادة التسخين إلى 72؟ يسمح C لإنزيم Taq polymerase بتمديد البادئات والتكرار الكامل للمنطقة المستهدفة.
يضاف التمهيدي النباتي الذي تم شراؤه إلى كل عينة ، وسوف يتضخم في العينات التي تحتوي على الحمض النووي للنبات. تستخدم القوالب الإيجابية للكائنات المعدلة وراثيا ل 35S و NOS لتوفير تحكم إيجابي للكائنات المعدلة وراثيا. يتم استخدام مادة معتمدة غير معدلة وراثيا كعنصر تحكم سلبي. إذا أظهر أي من تفاعلات التحكم هذه نطاقات غير متوقعة ، فلا يمكن الوثوق بنتائج عينات الاختبار.
يتم تشغيل الحمض النووي المضخم من خلال هلام الاغاروز عن طريق الرحلان الكهربائي. يتم خلط منتجات PCR مع صبغة وتحميلها في الآبار. الحمض النووي مشحون سالبا ، وعند تحميله في الجل في نهاية الكاثود من الغرفة ، سيتحرك نحو نهاية الأنود عند تطبيق التيار. لا يمكن لشظايا الحمض النووي الأكبر أن تتحرك بسهولة عبر مصفوفة الهلام ، لذا ستبقى أقرب إلى الكاثود ، بينما تتحرك التسلسلات الأصغر نحو نهاية الأنود ، مما يؤدي إلى فصل الحمض النووي بأحجام مختلفة إلى نطاقات متميزة.
بعد الرحلان الكهربائي ، يساعد تلطيخ الجل على تصور عصابات الحمض النووي المنفصلة.
الآن بعد أن أصبحنا على دراية بالمبادئ الكامنة وراء الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا واستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي لتحديد الكائنات المعدلة وراثيا ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تنفيذ ذلك في المختبر.
بمجرد تحديد المنتجات الغذائية ذات الأهمية ، يمكن أن يبدأ التحليل. لاستخراج الحمض النووي ، خذ أنبوبين لولبيتين نظيفين ، وفي كل من هذه الأنابيب 500؟ L من كاشف عزل الحمض النووي الذي تم شراؤه ، مع التأكد من ماصة المزيج لأعلى ولأسفل بين الحصص لخلط الكاشف بالتساوي. قم بتسمية أحد الأنابيب بأنه "غير معدل وراثيا" ، والآخر "اختبار".
بعد ذلك ، قم بوزن 0.5 جرام من الأطعمة المعتمدة غير المعدلة وراثيا ، وضعها في هاون نظيف. أضف 2.5 مل من الماء المقطر ، وطحنها بالمدقة لمدة دقيقتين لتشكيل ملاط. أضف 2.5 مل أخرى من الماء المقطر واستمر في طحن الملاط حتى يصبح ناعما بدرجة كافية للماصة.
الماصة 50؟ L من الملاط غير المعدل وراثيا المعروف إلى أنبوب الغطاء اللولبي المسمى "غير المعدلة وراثيا" الذي يحتوي على كاشف عزل الحمض النووي. أضف الآن 50؟ L من ملاط عينة طعام الاختبار إلى أنبوب الغطاء اللولبي الذي يحمل علامة "اختبار". دوامة الأنبوبين اللذين يحتويان على عينات الطعام وكاشف الحمض النووي لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في حمام مائي عند 95؟ ج لمدة 5 دقائق. أخيرا ، ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق. عند الفحص ، يجب تشكيل حبيبات صلبة في قاع الأنبوب. إذا لم يتم تشكيل الحبيبات بعد 5 دقائق, جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقتين حتى تتشكل الحبيبات. يمكن الآن استخدام العينات على الفور لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
أولا ، عدد ستة أنابيب PCR. تتوافق هذه الأرقام مع محتويات الأنبوب المدرجة في الجدول. ضع كل أنبوب من أنابيب PCR المسمى في حامل أنبوب دقيق مع أغطية مفتوحة.
باستخدام نصيحة جديدة لكل إضافة ، أضف 20 ؟ L التمهيدي المشار إليه في الجدول لكل أنبوب PCR. بعد ذلك ، أضف 20؟ L من عينات الحمض النووي الموضحة في الجدول لكل أنبوب PCR. الماصة لأعلى ولأسفل للخلط. بالنسبة للعينات المحببة ، تأكد من الماصة فقط من المادة الطافية ، وتجنب الحبيبات الصلبة في قاع الأنابيب. أخيرا ، ضع أنابيب PCR في جهاز تدوير حراري وقم ببرمجتها للتنقل عبر خطوات التسخين والتبريد الموضحة في الجدول.
ضع هلام الاغاروز بنسبة 3٪ في غرفة الرحلان الكهربائي مع الآبار الأقرب إلى نهاية الكاثود. أضف المخزن المؤقت TAE إلى الغرفة لتغطية 2 مم فوق صينية الجل. اجمع أنابيب PCR من جهاز التدوير الحراري وضعها في حامل الأنابيب الدقيقة. باستخدام طرف ماصة جديد في كل مرة ، أضف 10 ؟ L من صبغة تحميل الحمض النووي المشتراة لكل عينة وتخلط جيدا.
باستخدام طرف جديد في كل مرة ، قم بتحميل آبار جل الاغاروز ب 20؟ L من مسطرة الوزن الجزيئي في بئر واحد ، و 20؟ L من كل عينة في الآبار اللاحقة ، كما هو موضح في هذا الجدول. اضبط حجرة الرحلان الكهربائي لتعمل على 100 فولت لمدة 30 دقيقة.
بمجرد انتهاء تشغيل الجل ، افصل حجرة الجل بعناية ، وقم بإزالة الدرج ، وحرك الجل في صينية تلطيخ. اغمر الجل في صبغة جل 100x المشتراة لمدة 5 دقائق مع رج الدرج برفق لتوزيع البقعة. بمجرد تلطيخها ، انقل الجل إلى وعاء غسيل واشطفه بماء الصنبور لمدة 10 ثوان تقريبا. قم بغسلها عن طريق الغسيل ثلاث مرات بماء الصنبور الدافئ لمدة 3 دقائق لكل منها ، مع رج برفق للحصول على أفضل النتائج. إذا لزم الأمر ، استمر في البقع بالماء الدافئ حتى يتم الوصول إلى التباين المطلوب.
يشير وجود أو عدم وجود نطاق 200 نقطة أساس في الممر 4 إلى ما إذا كان طعام الاختبار يحتوي على كائنات معدلة وراثيا. تحدد الاشعال النباتية ما إذا كان قد تم استخراج الحمض النووي للنبات بنجاح من العينة. يعد التحكم في الأغذية غير المعدلة وراثيا مؤشرا على النتائج الإيجابية الخاطئة ، في حالة حدوثها. إذا كانت مراقبة الأغذية غير المعدلة وراثيا إيجابية ، فهذا يعني أن تفاعل البوليميراز المتسلسل كان ملوثا في مرحلة ما. يعد عنصر التحكم في القالب الإيجابي للمعدل المعدلة وراثيا مؤشرا على السلبيات الخاطئة. إذا لم يتم تضخيم عنصر التحكم في القالب الإيجابي للمعدلة وراثيا ، فهناك مشكلة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ولا يمكن الوثوق بالنتيجة السلبية المعدلة وراثيا من طعام الاختبار.
يمكن وضع المواد الهلامية على ورق أبيض أو أصفر لتوفير خلفية متباينة لتسليط الضوء على نطاقات الحمض النووي ، أو يمكن تحقيق زيادة التباين باستخدام صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
إن القدرة على اختبار المواد الغذائية أو المنتجات بحثا عن مكونات معدلة وراثيا ذات صلة بعدد من التطبيقات العلمية أو التنظيمية.
هناك بعض الأدلة على أن الحمض النووي المعدل وراثيا من المحاصيل المعدلة وراثيا يمكن أن يدخل في جينومات مجموعات المحاصيل البرية. على سبيل المثال ، قد تسهل الملقحات هذا النقل عن طريق تسميد النباتات البرية بحبوب اللقاح من مصدر معدل وراثيا. هذا مصدر قلق ، لأن آثار انتشار هذه الجينات المدخلة على النظم البيئية ككل ليست مفهومة جيدا. يمكن أن يوفر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للمجموعات البرية بيانات عن الانتشار المحتمل ، أو الاحتواء الناجح ، للإدخالات الجينية.
يمكن أن يكون عدم وجود الملصقات أو وضع العلامات غير الصحيحة على المكونات المعدلة وراثيا مصدر قلق للمستهلكين. قد يكون هذا بسبب تفضيل المستهلك للاستهلاك ، أو الإدخال المحتمل لمسببات الحساسية أثناء عملية التعديل المعدلة وراثيا ، على الرغم من أن هذا الأخير مثير للجدل. في بعض البلدان ، يلزم إدراج المكونات المعدلة وراثيا على عبوات المواد الغذائية. قد تستخدم المجالس التنظيمية في هذه البلدان اختبار PCR للتحقق من دقة وضع العلامات على الأغذية.
عندما يمنح التعديل الجيني الذي يتم إدخاله إلى المحصول مقاومة لمبيدات الآفات ، أثارت بعض الدراسات مخاوف بشأن إنتاج "الحشائش الفائقة". بشكل أساسي ، يمكن أن تكون هذه أي نبات لم يتم استهدافه في البداية للتعديل الذي يحصل على مقاومة المبيدات الحشرية من خلال آليات مثل الإدخال أو التهجين. قد تكون هذه النباتات قادرة بعد ذلك على الانتشار بشكل أكثر نجاحا ، ويكون من الصعب التحكم فيها أكثر من تلك التي لا تحتوي على الإدخال. يمكن أن يساعد اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل للتعديل الجيني في تسليط الضوء على هذه المجموعات السكانية المحتملة وتتبعها لتحديد ما إذا كان هذا الانتشار يمكن أن يكون مشكلة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لاختبار الأطعمة المعدلة وراثيا. يجب أن تفهم الآن المبادئ الكامنة وراء تحديد الأطعمة المعدلة وراثيا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وكيفية استخراج الحمض النووي وتضخيمه من الطعام ، وكيفية تحديد ما إذا كانت عينة طعامك قد تم تعديلها وراثيا. شكرا للمشاهدة!
بعد إزالة البقع ، يمكن تحليل المواد الهلامية من خلال النظر في ممرات الغذاء التجريبية ( الجدول 3 ) لتحديد ما إذا كانت نطاقات الحمض النووي لجينات محفز 35S و NOS Terminator موجودة في المواقع المعروفة على الجل. يمكن أن يساعد وضع الجل على صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية في توفير تباين متزايد ( الشكل 1 ). بدلا من ذلك ، يمكن وضع المواد الهلامية على ورق أبيض أو أصفر لتوفير خلفية متباينة لتسليط الضوء على نطاقات الحمض النووي ( الشكل 2 ).
يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم الحمض النووي ، مما يسمح بمجموعة واسعة من اختبارات مختبر الحمض النووي. أحد مجالات الاختبار الممكنة الآن باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تحديد الكائنات المعدلة وراثيا عن طريق اختبار وجود أو عدم وجود تسلسل الحمض النووي المستخدم في التعديل الجيني للمحاصيل الغذائية. عادة ما يتم تعديل المحصول وراثيا لمنح ميزة ضد الرادع الطبيعي للغلات المثالية ، مثل الآفات (الشكل 3) والأمراض وظروف الجفاف (الشكل 4) وما إلى ذلك. نظرا لأن الميزة يتم اك...
Chapters in this video
0:00
Overview
1:41
Principles of Identifying Genetically Modified Foods using PCR
4:44
Extraction of DNA from Food Samples
6:35
Setting up PCR
7:30
Electrophoresis of PCR Products
9:07
Results
10:10
Applications
12:15
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved