زراعة المستنبتات من النسيج العصبي

تُستخدم زراعة المستنبتات (Explant cultures) كتقنية لاستقصاء تطور مجموعات خلوية وهياكل عصبية محددة. وفي تجارب علوم الأعصاب التنموية، تكون المستنبتات عبارة عن أنسجة عصبية يتم استئصالها من الجنين لمواصلة نموها in vitro. تمنح هذه المزارع الباحثين القدرة على التحكم في الأنسجة النامية وتصويرها بطرق غير ممكنة in vivo. سيعرض هذا الفيديو بعض المبادئ الهامة المتعلقة بالعمل مع الأنسجة المستنبتة، والإجراءات التفصيلية لنهجين من زراعة المستنبتات، بالإضافة إلى تطبيقات هذه التقنية.

قبل الخوض في الطرق، دعونا نستعرض بعض المبادئ الأساسية. يمكن إنشاء المستنبتات من عدد من الكائنات النموذجية وأنواع مختلفة من الأنسجة. وبشكل عام، يتم إنشاء المزارع عن طريق إزالة النسيج العصبي بعناية من الجنين، وتشريح المنطقة المراد دراستها، ثم وضعها في بيئة اصطناعية.

كما يمكن تقطيع الأنسجة إلى شرائح رقيقة وزراعتها فيما يسمى "زراعة الشرائح". ونظراً لأن بيئة الزراعة مصممة لمحاكاة ظروف in vivo للعضو بأكمله، فإن استراتيجية الزراعة هذه غالباً ما تسمى "زراعة نمطية عضوية".

قبل البدء، تأكد من تعقيم أدواتك باستخدام ethanol بتركيز 70%. بعد ذلك، قم بقتل فأرة حاملة باستخدام الطريقة المعتمدة في مختبرك. ثم استأصل الرحم جراحياً وضعه في محلول منظم مبرد بالثلج. انقل الطبق إلى مجهر التشريح وقم بإزالة الأجنة الفردية من كيس المح. بعد ذلك، اعزل الدماغ، وشرح بدقة المنطقة المراد دراستها، وانقلها إلى طبق زراعة يحتوي على وسط زراعي. يمكن الحفاظ على المستنبتات في حاضنة عند 37 °C تحتوي على 5% CO2 لعدة أسابيع عن طريق استبدال 50% من الوسط كل 2 - 3 أيام.

تتطلب زراعة شرائح أنسجة الدماغ بضع خطوات إضافية. فقبل عملية التقطيع، يتم غمر النسيج في الآغاروز، مما يوفر دعماً للنسيج بحيث يظل سليماً أثناء تقطيعه. وللقيام بذلك، يتم تسخين محلول آغاروز بنسبة 1.5% منخفض درجة الانصهار حتى يذوب الآغاروز. بعد ذلك، يُنقل الآغاروز إلى قوالب التثبيت ويُترك ليبرد قليلاً لتجنب إتلاف النسيج.

يمكن بعد ذلك غمر النسيج بعناية وترك الآغاروز ليتصلب. ثم يتم تشذيب الكتل الناتجة ولصقها على منصة العينة وتقطيعها باستخدام جهاز الفايبراتوم (vibratome)، وهو جهاز يستخدم شفرة مهتزة لقطع شرائح رقيقة من الأنسجة الحية. ومع إنتاج الشرائح، يتم نقلها بعناية إلى طبق مغلف يحتوي على أوساط زراعية وتُزرع كما ذكر سابقاً.

هناك عدد من المزايا لاستخدام زراعة المستأصلات مقارنة بطرق الدراسة in vivo أو الطرق الأخرى in vitro. أولاً، تكون الخلايا في الأنسجة المستأصلة أكثر سهولة في الوصول إليها باستخدام الأدوات التجريبية. ثانياً، حقيقة أن المستأصلات تحافظ على البنية الخلوية المعقدة للأنسجة العصبية النامية تعني إمكانية دراسة التفاعلات بين الخلايا. ثالثاً، نظراً لقدرتهم على التحكم في التركيب الكيميائي لوسط الزراعة، يمكن للعلماء استخدام المستأصلات لاختبار تأثير مركبات محددة على تطور الأنسجة.

ومع ذلك، وبما أن النسيج يتم إزالته من بيئته الطبيعية، يجب اتخاذ عناية خاصة للحفاظ على سلامة وحيوية الأنسجة in vitro. على سبيل المثال، لوجود المادة الخلالية، أو ECM، تأثير كبير على سلوك الخلايا، لذا غالباً ما تُستخدم بروتينات ECM المنقاة لطلاء أطباق الزراعة. وهناك اعتبار مهم آخر وهو المحلول الذي تُغمر فيه المستأصلات؛ فبينما تُستخدم أوساط زراعة الخلايا التقليدية غالباً، تتطلب بعض التجارب محاليل تشبه إلى حد كبير السائل الذي يدور في الجهاز العصبي المركزي: السائل الدماغي الشوكي، وهو كاشف أساسي في تجارب مثل تلك التي ستشاهدونها الآن.

بعد أن استعرضنا طرق زراعة المستأصلات، دعونا نرى كيف تُستخدم هذه التقنيات.

تستخدم اختبارات هجرة الخلايا الأنسجة المستأصلة لفحص إشارات التنافر والجذب المشاركة في حركة الخلايا العصبية. في هذه التجربة، تُزرع حبيبات تم نقعها مسبقاً في عوامل نمو داخل مستأصلات من الدماغ الخلفي لفحص هجرة الخلايا العصبية. وبعد 3 - 4 أيام من التعرض، تم تصوير الخلايا العصبية باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope). وتظهر النتائج أن الخلايا العصبية الحركية تهاجر نحو الحبيبات المنقوعة في عامل نمو البطانة الوعائية، ولكنها لا تهاجر نحو حبيبات التحكم المنقوعة في المحلول المنظم.

غالباً ما تُستخدم اختبارات الزراعة المشتركة للتحقيق في التفاعلات بين الخلايا أثناء التطور. في هذا المثال، تمت زراعة قطع من الحبل الشوكي فوق طبقة من الخلايا العضلية لدراسة كيفية تكوين الروابط بين الخلايا العصبية الحركية الشوكية والعضلات الهيكلية. وفي وقت مبكر يصل إلى يومين بعد الحضن، تظهر بروزات من الخلايا العصبية، والتي تُعرف أيضاً باسم المستدعات العصبية (neurites)، وهي تخرج من المستأصل. وخلال 5 أيام، يُلاحظ حدوث تعصيب وظيفي من خلال انقباض طبقة الخلايا العضلية.

أثناء تطور الجهاز العصبي، يجب على الخلايا العصبية إطالة محاويرها لإنشاء اتصال بين النسيج المستهدف والجهاز العصبي المركزي. وتعد اختبارات توجيه المحاور إحدى طرق دراسة هذه العملية المعقدة؛ حيث يستخدم الباحثون الأنسجة المستأصلة لفحص العوامل الموجودة داخل الخلايا العصبية وفي البيئة المحيطة والتي تساعد في توجيه المحور إلى موقعه الصحيح.

لقد شاهدتم للتو دليل JoVE حول زراعة المستأصلات للأنسجة العصبية. غطى هذا الفيديو نظرة عامة على مزايا زراعة المستأصلات، واستراتيجيات الزراعة، والبروتوكولات التفصيلية لإجراءين شائعين من إجراءات الاستئصال، والطرق التي تُستخدم بها هذه التقنيات في المختبرات اليوم.

شكراً للمشاهدة!