توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

مرحبا ، أنا هيلاري كيمب من مختبر سيسيليا أوينز. وأنا سيسيليا أوينز. أنا وهيلاري في قسم العلوم الأساسية في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان في سياتل.

سنعرض لكم اليوم تقنية لصنع أجنة الزرد الخيمرية ، والمعروفة أيضا باسم الفسيفساء الجينية. يسمح لنا هذا الإجراء بتقييم الأساس الخلوي لوظيفة الجينات أثناء التطور. يمكننا أن نسأل عما إذا كان جين معين يعمل داخل الخلايا بنمط ظاهري متحور يعرف باسم الوظيفة المستقلة للخلية ، أو داخل بيئة تلك الخلايا المعروفة باسم عدم استقلالية الخلية.

نصنع هذه الفسيفساء عن طريق زرع الخلايا بين النوع البري من الأجنة الطافرة إما في مرحلة الأريمة أو مرحلة الجهاز الهضمي المبكرة. نقوم بعد ذلك بتقييم وظيفة الجينات من خلال مراقبة النمط الظاهري والنمط الجيني للخلايا المشتقة من المتبرع في بيئتها المضيفة. لذلك دعونا نبدأ.

في هذا الجزء من البروتوكول ، يتم حقن صبغة النسب في الجنين المتبرع بحيث يمكن متابعة مصائر الخلايا المشتقة من المتبرع بعد الزرع. يمكن أيضا حقن أي مجموعة متنوعة من الأحماض النووية باستخدام هذه التقنية ، ومع ذلك ، احذف خطوة الزخرفة عند حقن الحمض النووي قبل العمل مع الأجنة ، وقم بإعداد طبق الحقن عن طريق إدخال شريحة زجاجية بزاوية 45 درجة عبر أوسع جزء من طبق بتري. ثلاثة أرباع مليئة ب 1.2٪ أروس في وسط جنين البكتيريا العقدية.

قم بإزالة الشريحة بعد ضبط الزراعة لعمل حوض مشطوف. املأ الحوض الصغير بوسط جنين البكتيريا العقدية. تابع الآن الزخرفة الأنزيمية لأجنة مرحلة الخلية الواحدة.

احتضان الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة لمدة دقيقة إلى خمس دقائق في 0.5 ملليغرام لكل مليلتر. محلول بروناز. راقب الزخرفة عن كثب.

بمجرد أن يبدأ الكوريون في الانهيار بشكل واضح ، اغمر الأجنة في ماء النظام وهذا يسكب كل الكوريوم وتبقى الأجنة في أسفل منحنى المنقار. ومن المهم حقا ألا تصطدم الأجنة بسطح الماء مرة واحدة فقط ، ومعظمها قد خلع الكوريون. هناك عدد قليل من الدوامات حول الخارج والتي لا تفعل ذلك.

إذا كان هناك أي شيء لا يزال في كوره ، فإن عملية سحب العينة على هذا النحو ستؤدي إلى إخراجها ثم إطلاق الأجنة حتى لا تصطدم بسطح الماء أبدا. من المهم التعامل مع الأجنة المطلية بماصة مصقولة بالنار لتنعيم حوافها. انقل الأجنة المطلية بالديس الهشة برفق إلى حوض طبق الحقن باستخدام ماصة زجاجية مصقولة ذات تجويف واسع.

ثم نقوم بتحميل ملف واحد في هذا الحوض الصغير. الآن أصبحت الأجنة جاهزة للحقن بعلامة النسب باستخدام حريق معاير بدقة ، وماصة حقن زجاجية مسحوبة ، وجهاز حقن الضغط. سنستخدم طبقا مليئا بوسط الجنين لكسر الإبرة وطبقا مليئا بالزيت لمعايرة الإبرة.

هذا مجرد زيت معدني عادي من الدرجة المختبرية. نأخذ زوجا من ملقط صانعي الساعات الحادة ، ثم أثناء النظر من خلال قطع العين لتحديد الحجم المناسب ، نضع الملقط على جانبي الإبرة ثم نكسر الشريحة برفق ، وهو ما لا يمكنني فعله في الواقع دون النظر لتحديد حجم الصبغة أو الريبونوكليوتيد الذي يتم توصيله. قبل البدء.

قم بقياس حجم البلعة في طبق من الزيت المعدني. يجب قطع الإبرة بحيث يتم توصيل بلعة من نانولتر واحد بنبضة واحدة أو نبضتين من الحاقن الصغير. يمكن حساب حجم البلعة من قطرها كما تم قياسها بواسطة ميكرومتر العدسة.

حقن نانولتر واحد من محلول واحد إلى 3٪ من ديكستران الفلورسنت مباشرة في ylk من الأجنة المطلية بين مرحلتي الخلية الواحدة والأربع خلية. ما سأفعله هو وضع الجنين تحت الإبرة مباشرة. سأقوم بضرب الإبرة برفق في وسط الصفار والضغط على دواسة القدم.

بمجرد الحقن ، من المهم حقن في تيارات صفار البيض بحيث يتم نقل الصبغة إلى الخلايا. سيكون هذا الحقن كافيا لتتبع الخلايا في الأجنة الخيمرية خلال عدة أيام من التطور. من الناحية المثالية ، نقوم بذلك قبل أن تصل الخلايا إلى مرحلة الخلايا الأربع ، ورفع الأجنة المحقونة بكثافة منخفضة في طبق بتري مغطى مليء بجنين البكتيريا العقدية الطازجة. متوسط.

لاحظ أن الأجنة المحقونة تميل إلى أن يكون لها معدل نمو بطيء قليلا ، وتحتضن الأجنة في درجات حرارة مختلفة ، 25 و 28 و 31 درجة مئوية لترتيب نموها وتعظيم النافذة الزمنية التي يمكن خلالها إجراء عمليات الزرع. يتكون الجهاز المستخدم لزرع الخلايا في حشد أسماك الحمار الوحشي من حقنة هاميلتون يتم التحكم فيها بمحرك الأقراص متصلة بقضيب توقف ثلاثي الاتجاهات بخزان من الزيت المعدني وحامل ماصة صغير من خلال طول الأنابيب المرنة. تخلص من جميع فقاعات الهواء من النظام لأنها ستدمر قدرتك على التحكم في الشفط والضغط.

استخدم مجهر استريو يحتوي على بصريات عالية الجودة بتكبير DX على الأقل. للتحكم في وضع حامل الماصة الدقيقة والإبرة، نقترح مناور دقيق يدوي NARA shige. تأكد من تثبيته على المقعد باستخدام قاعدة مغناطيسية لمنع الاهتزازات من الانتقال إلى عملية الزرع.

تصنع إبر زرع الإبرة من ماصات زجاجية شعرية يتم سحبها إلى تفتق لطيف على قطب قطبي. راجع بروتوكول JoVE من مختبر Miriam Goodman للحصول على تفاصيل حول سحب الماصات تحت مجهر تشريح ، وكسر طرف الإبرة المسحوبة. بالنسبة لعمليات زرع مرحلة الأريمة ، يجب أن يقيس القطر الخارجي للإبرة حوالي 50 إلى 60 ميكرون أو 30 إلى 40 ميكرون لنقل مرحلة المعدة.

لكي يحسن نقل مرحلة الجهاز الهضمي الاختراق ، يجب سحب شوكة حادة في نهاية الإبرة باستخدام علف صغير أولا ، وتنعيم طرف الإبرة عن طريق تقريبها من خيوط الحدادة الدقيقة. ثم أدر الإبرة بحيث يمكن للحافة الأمامية للشطبة أن تتلامس مع الفتيل. بمجرد أن تلامس الحافة الأمامية للإبرة الفتيل ، اسحبه بعيدا بسرعة لإنشاء شوكة.

لتجنب إتلاف الخلايا ، يجب أن تكون الشائكة مستقيمة ويجب ألا ينحني طرف الإبرة مع تحضير الحفارة وإبر الزرع ، فأنت جاهز لصنع أجنة خيمرية. تستخدم عمليات زرع الأريمة لزرع الخلايا بين الأجنة عندما لا تكون معلومات خريطة المصير الدقيقة مطلوبة. باستثناء الخلايا الجرثومية البدائية ، فإن معظم الخلايا بشكل عام غير ملتزمة بمصير في هذه المرحلة.

خريطة مصير الأريمة هي أنه يمكننا التمييز بين الخلايا التي ستؤدي إلى ظهور الأديم الظاهر والخلايا التي ستؤدي إلى ظهور الأديم المتوسط. يقع الأديم المتوسط والأديم الباطن بالقرب من هامش جنين مرحلة الأريمة ، في حين أن الأسلاف الجلدية ، التي ستؤدي إلى ظهور الجهاز العصبي والأجلة السطحية ، تقع بعيدا عن هامش الجنين. لذلك عندما نزرع الخلايا في أجنة مرحلة الأريمة ، يمكننا استهداف تلك الخلايا إلى الأديم المتوسط المفترض أو الأديم الظاهر المفترض.

لكن لا يمكننا استهداف الخلايا إلى أي منطقة معينة من الأديم الظاهر أو الأديم المتوسط لأننا لا نعرف. في مرحلة الأريمة حيث يكون الجانب الظهري للجنين, إعداد أطباق الحقن مقدما عن طريق تعويم قالب بلاستيكي مع صفوف مزدوجة من نتوءات على شكل إسفين في طبق بتري, نصف مملوء بمنصهر 1.2٪ أروس في وسط الجنين. بمجرد أن تصلب الآروس ، قم بإزالة القالب تاركا صفوفا من الآبار المثلثة الشكل كل منها كبير بما يكفي لاستيعاب جنين واحد.

املأ قالب الزرع بوسط جنين القلم العقدي ، وقم بتحميل أجنة مرحلة الأريمة بشكل فردي في كل بئر باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار. الآن انقل الأجنة إلى آبار الزرع ، واسمح لها في البداية بالاستلقاء على جانبها. رتب الأجنة بحيث يتم وضع الأجنة المانحة أسفل عمود واحد ويتم وضع الأجنة المضيفة أسفل العمود المجاور.

ضع الطبق على المسرح بحيث عندما تدخل إبرة الزرع إلى الجنين ، تدفع الإبرة الجنين على الجدار الخلفي للبئر. باستخدام المناور الصغير ، قم بخفض إبرة الزرع في الطبق بزاوية شديدة الانحدار إلى حد ما. من الناحية المثالية ، يجب أن تدخل إبرة الزرع إلى الجنين بزاوية 45 درجة تقريبا.

بمجرد أن يكون طرف الإبرة تحت سطح وسط الجنين ، ارسم كمية صغيرة من وسط الجنين في الإبرة عن طريق لف محرك الميكرومتر الذي يتحكم في حقنة هاميلتون. للحصول على التحكم الأكثر دقة ، يجب أن تظل الواجهة بين الزيت المعدني ووسط الجنين في الجزء المدبب الرقيق من الإبرة ، وليس قريبا جدا من النهاية. ضع الجنين المتبرع برفق بالإبرة ثم اسحب الإبرة للخلف وأدخل غطاء الأريمة للجنين في الموضع المطلوب.

ستخترق الضربة القوية السريعة الجنين دون التسبب في تدحرجه. ارسم الخلايا المانحة ببطء وحذر في الإبرة لتجنب قص الخلايا. تجنب أخذ صفار البيض في الإبرة بعد تناول العدد المطلوب من الخلايا.

عكس الضغط قليلا لإيقاف الشفط وإزالة الإبرة من إحضار الجنين المضيف إلى موضعه. عن طريق تحريك طبق الزرع ، يمكن إجراء تعديلات صغيرة على موضع الجنين المضيف عن طريق تدويره برفق باستخدام إبرة الزرع طالما تم توخي الحذر لعدم لمس صفار البيض. عند طرد الخلايا المانحة إلى الجنين المضيف ، تجنب أخذ ylk إلى الجنين لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف وقتل الخلايا المانحة من جنين متبرع واحد يمكن زرعها إلى مضيفين متعددين بعد اكتمال عمليات نقل الخلايا.

انقل أزواج المضيفين المانحين إلى الآبار المطلية بلوحة 24 بئرا لمواصلة التطور. الاستثناء الوحيد لقاعدة عدم التزام الخلايا بمصائر معينة في مرحلة الأريمة هو الخلايا الجرثومية البدائية. يتم تحديد خلايا الخلايا الجرثومية البدائية في وقت مبكر جدا من التطور وهي ملتزمة بمصير حالة الخلايا الجرثومية البدائية.

منذ مرحلة مبكرة جدا ، تقع الخلايا الجرثومية البدائية بالقرب من هامش الأريمة وجنين مرحلة المعدة. لذلك إذا كان الهدف من تجربة الزرع هو زرع الخلايا الجرثومية البدائية ، فمن المهم جدا من أين تأتي الخلايا في الجنين المتبرع وليس من المهم إلى أين تذهب إلى الجنين المضيف. لذا فإن القاعدة هي أنه بالنسبة للخلايا الجسدية ، من المهم إلى أين تذهب في الجنين المضيف الذي سيحدد مصيرها.

في حالة الخلايا الجرثومية البدائية ، من المهم من أين تأتي في الجنين المتبرع لأن مصيرها محدد بالفعل. إذا كان الهدف هو زرع الخلايا الجرثومية البدائية ، فهذا ، يجب التقاط الخلايا من هامش أمل الجنين المتبرع ، وتقع بالقرب من هامش الجنين في أربع مجموعات صغيرة من كل من ثلاث أو أربع خلايا في هذه الورقة ، هذه المرحلة الرمحية أو المرحلة العالية من التطور. وعليك أن تلتقطها بحذر شديد حتى لا تبدأ في امتصاص صفار البيض عن طريق الخطأ.

حسنا ، وهذا ما فعلته هناك ، والآن أنتقل إلى جنين مضيف. الآن سوف تصقل الخلايا الجرثومية البدائية في منطقة التلال التناسلية لأي جنين موجودة فيه. لذلك ليست هناك حاجة لزرع هذه الخلايا الجرثومية البدائية إلى الهامش الذي ستصل إليه بأنفسهم.

لذلك أنا فقط أقوم بزرعها وإعادتها إلى أي مكان قديم في ما بعد الجنين. مفتاح زراعة الخلايا الجرثومية ، وهو عكس أي نوع آخر من عمليات الزرع ، هو أنه مهم من أين تأتي الخلايا المانحة. يسمح زرع الخلايا في مضيف مرحلة المعدة للمجرب بالاستفادة من خريطة مصير أسماك الزرد الحمار الوحشي التي تظهر عندما يصبح الدرع الجنيني مرئيا.

يصبح من الممكن التمييز بين أنواع الأنسجة المختلفة وكذلك المجالات داخل الجهاز العصبي المركزي المفترض. عند نقل الخلايا بين الأجنة في مرحلة قائمة المعدة، هناك بعض الاختلافات في البروتوكول، لكن الإجراء العام يشبه العمل مع الأرومة لتركيب المعدة. قم أولا بتلطيخ شريط رأسي من ميثيل السليلوز في انخفاض شريحة الاكتئاب الزجاجي ، ثم غمرها بكمية كبيرة من وسائط جنين القلم العقدي باستخدام نقل ماصة مصقولة بالنار.

متبرع واحد وثلاثة دروع تستضيف شريحة الاكتئاب. اختر أجنة المتبرعين الأصغر سنا قليلا من المضيفين. مطلوب أداة جديدة لمعالجة غراء المعدة ، نهايات خط الصيد التجريبي بطول قصير يبلغ رطلين في نهاية أنبوب شعري.

وبالتالي صنع حلقة صغيرة. استخدم الحلقة لدحرجة الأجنة المانحة والمضيفة برفق على الجزء العلوي من شريط ميثيل السليلوز وحشوها في ميثيل السليلوز حتى يتم تثبيتها. قم بلفها في موضعها بحيث تكون المنطقة المستهدفة في الأعلى.

نظرا لأنه أثناء الزرع ، ستدخل الإبرة إلى الجنين بشكل عرضي لتوصيل الخلايا المانحة دون الإضرار ب ylk. من الأفضل إجراء عمليات زرع المرحلة الهضمية على مجهر مركب ثابت المرحلة. استخدم عناصر التحكم في المعالج الدقيق لتركيز طرف إبرة الزرع.

ضع حامل الماصة الصغيرة والإبرة بزاوية ضحلة إلى حد ما بحيث تكون الإبرة قريبة من الأفقية بقدر ما تسمح به حافة المنخفض على الشريحة. بعد ذلك اخترق الجنين المتبرع. إذا تم تركيبه بشكل صحيح ، فلن يتدحرج عند دخول إبرة الزرع ما لم يكن الجنين أكبر من أن يسمح للإبرة بالاختراق بسهولة.

لتجنب ثقب الإبرة ، يجب أن تدخل الإبرة إلى الجنين في مستوى بؤري أعمق قليلا من مستوى EDL. بمجرد ثقبها ، يمكن إزالة عدد كبير من الخلايا من المتبرع لما يصل إلى ثلاث حقن للخلايا المضيفة. عند رسم الخلايا ، تجنب امتصاص صفار البيض عن طريق تحريك الإبرة حيث يتم امتصاص الخلايا إذا رغبت في ذلك.

يمكن حصاد أجنة إضافية لمزيد من الخلايا باستخدام نفس الإبرة قبل إخراج الخلايا إلى المضيف ، أثناء طرد الخلية في الجنين المضيف ، طرد الخلايا أثناء سحب الإبرة عبر المنطقة المستهدفة بدلا من ترسيب الخلايا في كتلة واحدة. سيؤدي ذلك إلى زيادة احتمالية مساهمة الخلايا المانحة في الأنسجة المرغوبة. بمجرد اكتمال عمليات نقل الخلية ، ضع الشريحة بأكملها في طبق بتري وقم بإغراقها بعناية بجنين البكتيريا العقدية. متوسط.

خلال الساعات القليلة المقبلة ، سوف يذوب ميثيل السليلوز ويطلق الأجنة. يعتمد عدد الخلايا المنقولة على الهدف المحدد للتجربة. يمكن زرع خلايا من متبرع واحد في ثلاثة أو أربعة مضيفين في صباح اليوم التالي للزرع.

يمكن فحص المضيفين لتحديد ما إذا كان استهداف الخلايا المانحة ناجحا. يؤدي الزرع الناجح للخلايا الجرثومية البدائية من عمر الأريمة إلى خلايا مصنفة بالفلورسنت ، يتم وضعها بطنيا بالقرب من التقاطع بين ylk وامتداد ylk. لذلك أوضحنا لك للتو كيفية إجراء عمليات زرع المعدة والمتبرعمة.

عند القيام بهذه التقنية ، من المهم اختيار النوع المناسب من طريقة الزرع للأنسجة المستهدفة التي تأمل في استهدافها بخلاياك. لذا فإن زراعة مرحلة الأريمة كافية لتحديد انتقال الخلايا إلى الجلد مقابل الأديم الظاهر ويمكنك أيضا استخدام هذه التقنية لاستهداف الخلايا الجرثومية البدائية.

إذا كنت ترغب في إجراء رسم خرائط أدق ، فمن الأفضل استخدام عملية زرع عمر المعدة حيث تم تحديد الجانب الظهري بالفعل. وهكذا باستخدام هذه التقنية ، يمكنك استهداف الخلايا لأجزاء مختلفة من الجهاز العصبي ، على وجه الخصوص ، الدماغ الأمامي والدماغ الأوسط والدماغ الخلفي والحبل الشوكي. هذا كل شيء.

شكرا جزيلا على المشاهدة ونتمنى لك التملك التوفيق في جميع تجاربك.