صامت Presynaptically الوصلات العصبية درس مع المجهر الضوئي

تبدو بعض الأطراف قبل المشبكية في الجهاز العصبي المركزي غير وظيفية أو صامتة. نقدم هنا بروتوكولا لتحديد المحطات الصامتة قبل المشبكي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحديد العلاجات والتلاعب التي يشتبه في إسكات أو إيقاظ المحطات الطرفية.

يجمع البروتوكول بين وضع العلامات على الصبغة الحيوية للحويصلات المشبكية أثناء إزالة الاستقطاب العصبي مع وضع العلامات اللاحقة للخلايا الثابتة بجسم مضاد يصنف جميع الأطراف قبل المشبكية ، الصامتة والنشطة. متشابك. Co المسمى بالصبغة والأجسام المضادة نشطة. المشبك المسمى فقط بواسطة الجسم المضاد صامت.

مرحبا ، أنا أماندا تايلور من مختبر الدكتور ستيف مينيك في قسم الطب النفسي في كلية الطب بجامعة واشنطن. أنا شاهين أيضا من مختبر الهوس. نود اليوم أن نعرض الإجراء الخاص بك لتصور المحطات الصافئة قبل المشبكية باستخدام الخلايا العصبية الحصين المستنبتة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية قيام النشاط الكهربائي ومسارات النولينغ الفردية الأخرى بتعديل إطلاق الناقل العصبي. لذلك دعونا نبدأ. في غطاء التدفق الصفحي المعقم ، لا يمكن استخدام HIPA من صفر إلى ثلاثة فئران أو فئران لتحضير مزارع الخلايا المنفصلة.

وفقا لبروتوكولنا المنشور ، فإن ثقافاتنا عبارة عن مزارع دبقية مختلطة ، يجب طلاء الثقافات المشتقة من نفس خلايا التشريح في أطباق معقمة مقاس 35 ملم. يحتوي كل منها على زلة غطاء صفرية مطلية بخمسة ملليغرام لكل مليلتر من لوحة الكولاجين. الخلايا العصبية بكثافة تقريبية تبلغ 500 خلية لكل سنتيمتر مربع.

ما ينتج 12 جروا من الفئران 30 طبقا 35 ملم. اسمح للثقافات بالنمو في حاضنة ثقافة لمدة 10 إلى 14 يوما. لتطوير التشابك والنضج ، أضف المضاد الانقسام A C لإيقاف النمو الدبقي في اليوم في المختبر الرابع.

أيضا في اليوم في المختبر الخامس ، قم بإجراء تبادل نصف متوسط مع الوسيط القاعدي العصبي بالإضافة إلى ملحق B 27 لتعزيز بقاء الخلايا العصبية خلال فترة النضج هذه. إدخال العلاجات التي تغير عدد نقاط الاشتباك العصبي الصامتة قبل المشبكي. نجد أن إحدى الطرق الملائمة لإسكات نسبة كبيرة من نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات هي علاج لمدة أربع ساعات ب 30 مللي مولار من البوتاسيوم.

عندما تنضج الثقافات ، يجب أن يكون للخلايا العصبية كثافة منخفضة نسبيا مع عمليات عصبية منفصلة جيدا وواسعة النطاق. قم بإزالة الثقافات من الحاضنة وإحضارها إلى المقعد. استبدل وسط الاستزراع بمحلول ملحي مخزن يحتوي على 45 مللي مولار كلوريد البوتاسيوم و 10 ميكرومولار FM 1 43 FX يموت.

يجب أن يحتوي هذا الحل أيضا على NBQX و A PV لمنع الإشارات المتكررة. من المهم أن يتم الاحتفاظ بحل وتجارب الأسهم FM 1 43 FX في الظلام لمنع التبييض الضوئي. لذا قم بتغطية أطباق الثقافة بورق الألمنيوم لجميع خطوات الحضانة اللاحقة.

احتضن لمدة دقيقتين بالضبط في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الصبغة واغسله لمدة ثلاث إلى خمس ثوان فقط في أكوام من محلول ملحي مخزن مع 500 ميكرومولار عدي. سبعة. لإزالة توقيت الصبغة غير المحدد في هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية.

نظرا لأن التعرض المطول ل adv negative F seven سيزيل جميع ملصقات FM 43 FX. ثم اغسل الخلايا وأكوام المحلول الملحي المخزن دون ضرر مضاد. سبعة لخمس فترات دقيقتين في غطاء دخان كيميائي.

قم بإصلاح الثقافات في 4٪ بارالديهايد و 0.2٪ جلوتارالديهايد في PBS لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام PBS. يمكن الآن نقل الخلايا من غطاء الدخان.

أضف محلول مانع يحتوي على 4٪ مصل ماعز عادي و 0.04٪ تريتون X لتقليل الخلفية واختراق الخلايا للتلوين المناعي. احتضن لمدة 15 دقيقة. تلطيخ الخلايا بجسم مضاد VLU T واحد مخفف إلى واحد إلى 2000 في محلول حجب

احتضان الثقافات في الجسم المضاد مع هزاز لطيف لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS. احتضان الخلايا باستخدام Alexa.

6 47 الجسم المضاد المترافق المضاد لخنزير غينيا مخفف إلى واحد إلى 500 في محلول حجب حافظ على الثقافات في الجسم المضاد الثانوي مع هزاز لطيف لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا أربع مرات أخرى باستخدام PBS.

ضع قطرة صغيرة من كمية الأرضية على شريحة زجاجية نظيفة باستخدام ملقط. التقط زلة غطاء وقم بخفضها برفق على قطرة خلايا كمية الأرضية التي تواجه الشريحة. اترك الشريحة تجف طوال الليل.

قم بإعداد هدف زيت 60 × على مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. ضع شريحة على المسرح بحيث تواجه زلة الغطاء الهدف. ابحث عن حقل من العصبات غير كثيفة بشكل مفرط وبعيدا عن سوما الذي يمكن أن يحتفظ بالصبغة المتبقية.

قم بالتكبير إلى حجم حقل 51 × 51 ميكرون. استخدام برنامج الحصول على الصور. احصل على مكدس ZS يغطي عمق 7.8 ميكرون على 27 خطوة بحجم 0.3 ميكرون لكل خطوة.

افحص أولا الجسم المضاد VLU T واحد لتحديد جميع نقاط الاشتباك العصبي في هذا المجال. ثم أعد البحث عن مضان FM 1 43 FX لتحليل الصور بعد الاستحواذ. استخدم برنامج التحليل لتحويل Z tac إلى صورة مركبة أحادية المستوى بناء على الحد الأقصى لقراءة الكثافة من أي مستوى عند كل عتبة مجموعة بكسل.

لتقليل الخلفية ، حدد أطراف VG glu T one دون الرجوع إلى بقعة تأثيرات FM 1 43. وقم بتمييز هذه النقاط كمناطق ذات أهمية. نختار عادة 10 PUNTA لكل حقل.

كرر تحديد العتبة والنقطة على صورة تأثيرات FM 1 43 وقم بتركيب الصور لتحديد نقاط الاشتباك العصبي الصامتة. يمكن استخدام معيار البكسل المطلق ، أو معيار النسبة المئوية للبكسل للتمييز بين FM النشط 1 43 إيجابي من المشابك السلبية FM 1 43 غير النشطة. في ثقافاتنا ، نجد أن 70 إلى 80٪ من نقاط الاشتباك العصبي الغلوتامات المحددة بواسطة V glut one تلطيخ يظهر تلطيخ FM 1 43 يمكن اكتشافه في صور متراكبة من التألق الأخضر FM 1 43 واللون الأحمر V glut تلطيخ واحد.

يتضح هذا على أنه وفرة من نقاط الاشتباك العصبي الصفراء مع علامات موضعية مشتركة. يشار إلى هذه الأسهم. ما يقرب من 20 إلى 30٪ من التخمة الحمراء V التخمة النقطية الإيجابية الواحدة ستفشل في الحصول على مضان FM 1 43 أخضر فوق خط الأساس.

هذه هي المحطات قبل المشبكية غير النشطة ويشار إلى مثال بواسطة رأس السهم. كما سيتم ملاحظة مجموعة ثالثة من نقاط الاشتباك العصبي. هذه إيجابية لمضان FM 1 43 الأخضر ، ولكنها خالية من تلطيخ B الأحمر.

هذه هي نقاط الاشتباك العصبي GABAergic النشطة ويشار إلى مثال على ذلك بواسطة علامة النجمة. يتم استبعادها من معظم تحليلاتنا ، ولكن يمكن دراستها بشكل صريح باستخدام الجسم المضاد الناقل الحويصلي GABA. بدلا من الجسم المضاد VLU T واحد ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية تصور المشابك الصامتة قبل المشبكي باستخدام FM 1 43 و VLU تلطيخ مناعي واحد.

عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن FM 1 43 FX حساس لكل من الوقت في غسل adver sub seven وتركيز المعالجة X 100 المتضمن في محلول الحظر. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.