جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

يصف هذا البروتوكول على تطوير جهاز للتحقيق في ميكروفلويديك الكيميائي الجرثومي في التدرجات تركيز chemoeffectors مستقرة.

يتم إدخال الإشريكية القولونية RP 4 37 في جهاز الانجذاب الكيميائي حيث يتعرضون للتركيز المكاني المحدد. تواجه خلايا التدرجات التي تدخل الغرفة نقطة منتصف تدرج التركيز. اعتمادا على ما إذا كان ينظر إلى الإشارة على أنها جاذب أو طارد للبكتيريا تتحرك بسرعة إما لأعلى أو لأسفل تدرج التركيز.

مرحبا ، أنا ديريك إنجلر من مختبر التكنولوجيا الحيوية للأنظمة الجزيئية وقسم الهندسة الكيميائية في جامعة تكساس أ و م. سنعرض لك اليوم إجراء يفحص ضرائب العلاج الكيميائي البكتيري في جهاز ميكروفيليديك. نستخدم هذا الإجراء في مختبراتنا لدراسة كيفية هجرة الإشريكية القولونية RP 4 37 في تدرج تركيز كبريتات النيكل.

لذلك دعونا نبدأ. يتم تصنيع الطبقة السائلة وطبقة التحكم عن طريق قولبة طبق الأصل من Polymethyl SUBOXANE أو PDMS من SU ثمانية سيد. لبدء هذا الإجراء ، امزج البوليمر المسبق PDMS والرابط المتقاطع بنسبة وزن 10 إلى واحدة.

ينزع الخليط في مجفف لمدة ساعة حتى تتم إزالة فقاعات الهواء. عندما يصبح خليط PDMS جاهزا ، ضع SU eight master في طبق بتري واسكب الخليط بعناية فوق SU eight master إلى السماكة المطلوبة الحرارة. طبق بتري الذي يحتوي على PDMS و SU ثمانية قالب رئيسي عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين لعلاج PDMS.

بعد ساعتين ، قم بإزالة PDMS المعالج المغطى SSU ثمانية من اللوحة الساخنة وقشر قالب PDMS من SU ثمانية سيد. سيتم تضمين الهيكل المطلوب في قالب PDMS باستخدام إبرة نهاية حادة قياس 20 تثقب أربعة ثقوب في قالب PDMS للأنابيب إلى مولد التدرج ومدخل الخلية ومخرج الخلية. نحن الآن جاهزون لتجميع جهاز PDMS لربط جهاز PDMS.

أولا ، قم بتنظيف شريحة المجهر الزجاجي باستخدام الأيزوبروبانول وجربها باستخدام Airstream. بعد ذلك ، قم بتعريض قالب PDMS والشريحة الزجاجية لبلازما الأكسجين في حفرة البلازما لمدة 30 ثانية تقريبا. اجعل قالب PDMS ملامسا للشريحة الزجاجية قم بتسخين الشريحة الملامسة وقالب PDMS إلى 65 درجة مئوية على لوح ساخن لمدة 15 دقيقة.

لتجميع جهاز PDMS ، استخدم شفرة حلاقة لقطع الأنابيب بزاوية 45 درجة إلى الطول الصحيح المطلوب اعتمادا على إعداد المجهر. ثم باستخدام الملقط. أدخل أحد طرفي الأنبوب في أحد الثقوب الأربعة المثقوبة في الجهاز.

أدخل محور إبرة غير حاد قياس 30 في الطرف الآخر من الأنبوب. كرر إدخال الأنبوب ومحور الإبرة لجميع الثقوب المتبقية. قم بتحميل مليلتر واحد من الضرائب الكيميائية أو العازلة أو CB في حقنة ثلاثة ملليلتر.

الحرص على إزالة الهواء من المحقنة. أضف CB إلى محور إبرة المخرج باستخدام ماصة واضغط على محور الإبرة لإزالة أي فقاعات هواء. ادفع القليل من CB من طرف المحقنة التي يبلغ وزنها ثلاثة ملليلتر وقم بتوصيل المحقنة بمحور الإبرة دون حبس الهواء.

ادفع CB عبر الجهاز حتى تمتلئ جميع محاور الإبرة المتبقية ب cb. يجب أن يزيل هذا غالبية فقاعات الهواء. بعد ذلك ، املأ حقنتين سعة 500 ميكرولتر ب CB تحتوي على التركيزات المناسبة من المستجيب الكيميائي الذي يتم اختباره.

تخلص من تكوين فقاعة الهواء عن طريق دفع قطرة صغيرة من محتويات المحقنة ولمس قطرات السائل في محور الإبرة وربط المحقنة لتحضير بكتيريا عالية الحركة. بالنسبة لتجربة الانجذاب الكيميائي ، قم بزراعة ثقافة بين عشية وضحاها من الإشريكية القولونية RP 4 37 مع تعبير GFP ، أو البلازميد في مرق تريبتون أو السل عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز في اليوم التالي. استخدم المزرعة الليلية لتلقيح مزرعة السل سعة 20 مليلتر في قارورة إرلينماير سعة 250 مليلتر إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر تبلغ حوالي 0.05.

قم بزراعة المزرعة عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز عندما تكون الخلايا عند OD 600 من حوالي 0.35 إلى 0.45. حصادها عن طريق عمليات الطرد المركزي منخفضة السرعة ، وقم بتعليق الخلايا إلى OD 600 يبلغ حوالي 0.35 في CB يحتوي على المستجيب الكيميائي عند التركيز المتوقع في منتصف القناة. أخيرا ، أضف الخلايا الميتة المسماة RFP في رقم D 600 حوالي 0.35 إلى GFP التي تعبر عن الخلايا الحية.

ستكون هذه الخلايا الميتة رقابة داخلية للتأكد من أن أي هجرة ليست بسبب تأثيرات التدفق. معلق الخلية جاهز الآن للتحميل في جهاز الموائع الدقيقة لتجربة الانجذاب الكيميائي. لبدء تجربة الانجذاب الكيميائي ، قم بإزالة بعض CB من إعادة تعبئة محور إبرة مدخل الخلية بتعليق الخلية.

املأ حقنة سعة 50 ميكرولتر برفق بالخلايا المعلقة. افعل ذلك ببطء حيث يمكن قص السوط ، مما يقلل من الحركة. قم بتوصيل المحقنة سعة 50 ميكرولتر بمحور إبرة المدخل كما هو موضح سابقا عن طريق دفع قطرة صغيرة من محتويات المحقنة ولمس القطرة بالسائل الموجود في محور الإبرة وربط المحقنة بوضع الجهاز على منصة المجهر الفلوري المزود بكاميرا عالية السرعة للحصول على الصور.

ضع كل من محاقن المدخل في مضخة الحقنة وابدأ التدفق بحيث يتشكل التدرج وتتدفق الخلايا عبر الأنبوب. بمجرد دخول الخلايا إلى غرفة الضرائب الكيميائية، انتظر حوالي 20 دقيقة حتى يستقر النظام. قبل التصوير ، اجمع صورا مضان خضراء وميتة حية في مواقع مختلفة على طول الغرفة.

عادة ما نجمع 100 صورة في كل موقع على فترات ثلاث ثوان. يمكن تحليل الصور الفلورية التي تم الحصول عليها باستخدام أي برنامج تحليل صور متاح تجاريا مثل Image J أو Metamorph ، أو باستخدام رموز بسيطة مكتوبة في matlab. في هذا المثال، سنستخدم أكواد MATLAB.

ابدأ بإزالة وحدات بكسل الخلفية في الصورة من خلال كثافة البكسل العتبة المحددة هذه ، وقم بإزالة جميع وحدات البكسل التي تكون شدتها أقل من الحد. هذا يقلل من الضوضاء. في التحليل ، استخدم موضع الخلايا الميتة لتحديد مركز الصورة.

يمثل هذا الموضع الذي دخلت فيه الخلايا إلى غرفة الانجذاب الكيميائي وحيث سيتم اكتشافها في حالة عدم وجود أي هجرة. بعد ذلك ، حدد موقع الخلايا الحية في الصورة ، وقسم الصورة إلى قنوات وحدد عدد الخلايا الحية في كل قناة. في عملنا السابق ، تم تقسيم غرفة الضرائب الكيميائية بعرض 10 50 ميكرومتر إلى 64 قناة يبلغ عرض كل منها حوالي 16 ميكرومتر.

بعد تكرار هذه الخطوات لجميع الصور، يتم احتساب بعض إجمالي الخلايا لكل قناة عبر جميع الصور. هذا يعطي إجمالي عدد الخلايا المكتشف في كل قناة خلال مدة التجربة. احسب ضرائب العلاج الكيميائي أو معامل التقسيم أو تكلفة النقرة ، والتي تمثل اتجاه الترحيل.

من خلال تنفيذ الخطوات التالية ، قم بتعيين مضاعف زائد واحد وناقص واحد لكل خلية تقع في التركيز العالي أو التركيز الأيمن والمنخفض أو الجانبين الأيسر من الخلايا الميتة على التوالي. اجمع جميع القيم المضاعفة وقم بتطبيعها إلى العدد الإجمالي للخلايا المكتشفة. احسب ضرائب العلاج الكيميائي أو معامل الهجرة أو CMC ، الذي يزن هجرة الخلايا بالمسافة المقطوعة.

يتم إعطاء الخلية التي تنتقل إلى أبعد قناة موضع تركيز عالي 64 عامل ترجيح زائد واحد ، بينما يتم إعطاء الخلية التي تتحرك في منتصف الطريق إلى جانب التركيز الأعلى عامل وزن زائد 0.5 وخلية يتم ترجيح الانتقال إلى أبعد موضع تركيز منخفض بمقدار سالب واحد. يتم حساب بعض الخلايا المرجحة وتطبيعها وفقا لعدد الخلايا لتوليد CMC.

يوضح هذا الرسم البياني تدرج تركيز خطي أو ملف تعريف يتكون في جهاز الموائع الدقيقة باستخدام إيزوثيوسيانات الفلورسين. يظهر تكوين تدرج تركيز في هذا الشكل باستخدام أصباغ اللون الأزرق والأصفر. كان مدخل الخلية هو CA بحيث لم يكن هناك تدفق من خلاله ، ويمكن ملاحظة أن مجموعة من الألوان بين الأزرق والأصفر.

فيما يلي صور زائفة ملونة من تجربة الانجذاب الكيميائي التمثيلية التي تعرض فيها القولونية RP 4 37 لتدرج من صفر إلى 100 ميكرومولار L aspartate أو صفر إلى 225 ميكرومولار من كبريتات النيكل في الجهاز. تم تصوير هجرة البكتيريا الخضراء الحية نحو الأسبارتات أو بعيدا عن النيكل كل 2.5 ثانية لمدة 30 دقيقة. كانت البكتيريا الميتة الموضحة باللون الأحمر بمثابة عنصر تحكم في تأثيرات التدفق في الجهاز.

التوزيع المكاني ل RP 4 37 في جهاز الموائع الدقيقة في حالة عدم وجود تدرج في هذا الرسم البياني مقارنة باستجابته لتدرج الأسبارتات وتدرج كبريتات النيكل. لقد أوضحنا لك للتو كيفية مراقبة الضرائب الكيميائية للإشريكية القولونية RP 4 37 في تدرج كبريتات النيكل. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل دوامة الخلايا بحيث يمكن استخدام مجموعة سكانية فرعية عالية الحركة.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.