نظام التعبير المزدوج القائم على تكميل GFP لتقييم ملامسة الخلية الخلوية بوساطة السيتونيمات في الأقراص الخيالية لجناح ذبابة الفاكهة الحية

لذلك يركز بحثنا على فهم كيفية تواصل الخلايا البعيدة في الأنسجة مع بعضها البعض. نحن نستخدم ذبابة الفاكهة القرص التخيلي للجناح كنظام نموذجي لمحاولة فهم كيفية تكوين السيتيدين ، وكيف يعمل ، وما هو الدور الذي يلعبه في التحكم المحلي في نمو الأنسجة. تشير الدراسات إلى أن عوامل النمو غالبا ما تنتقل عبر الإسقاطات الخلوية المتخصصة مثل خيوط الأبد المستندة إلى الأكتين ، والتي تسمى السيتونيم من أجل توصيلها إلى الخلايا المستهدفة.

السيتونيم عبارة عن هياكل رقيقة وهشة للغاية يمكن تعطيلها بسهولة بواسطة بروتوكول التثبيت. لمراقبتها ، تحتاج إلى استخدام أساليب التصوير الحي المخصصة مع البروتين الموسوم بالفلورسنت. هذا يحد بشكل كبير من الأداة والأساليب التي يمكننا استخدامها للتحقيق فيها.

حددنا بروتين كيناز يسمى Slik يشارك في تكوين السيتونيم الحيوي. يؤدي التعبير عن Slik في طبقة فوق الجافية واحدة في القرص التخيلي للجناح إلى تكوين السيتونيم الذي عبر تجويف القرص ويحفز تكاثر الخلايا في الطبقة الظهارية المجاورة. في المستقبل ، نود تحديد البروتين الذي يعمل في اتجاه مجرى Slik لتعزيز تكوين السيتونيم ، لتحديد الترابط الذي يتم توصيله عبر هذا السيتونيم لتعزيز الثقب ، وفهم الأهمية الفسيولوجية لهذه الآلية في التحكم في نمو الأنسجة بشكل أفضل.

للبدء ، قم بقطع الآبار الفردية من الشريط المكون من ثمانية آبار باستخدام المقص ثم قطع كل بئر إلى نصفين. قم بإزالة الدعامة الواقية من جانب واحد من كل نصف وألصق الفواصل على شريحة المجهر ، مع تباعدها قليلا لإنشاء مساحة مركزية محمية لوضع القرص. اختر يرقات الطور الثالث المتجولة من أنبوب التربية بعد العبور الجيني والحضانة عند 25 درجة مئوية.

تحت مجهر تشريح ، انقل اليرقات إلى قطرة من وسط التصوير الحي على طبق بتري مغطى بالسيليكون. باستخدام ملقطين للتشريح ، ابدأ التشريح عن طريق قرص اليرقات بطول الجسم حوالي 1/3 من الأمام بزوج واحد من الملقط لإبقائها ثابتة. باستخدام الزوج الثاني ، اضغط على الجسم خلف النقطة الأولى واسحب لفصل النصف الخلفي ، وعزل الجزء الأمامي.

اقلب النصف الأمامي عن طريق الإمساك بجانبي الطرف المقطوع بالملاقط ودفع الرأس باستخدام زوج ثان ، وقلبه من الداخل إلى الخارج. هذا يكشف عن الهياكل الداخلية مثل الأقراص التخيلية والقصبة الهوائية والغدد اللعابية والجسم الدهني والأمعاء. قم بإزالة الغدد اللعابية والجسم الدهني والأمعاء باستخدام الملقط ، مع الحرص على عدم إزعاج جذوع القصبة الهوائية الجانبية التي تغطي أقراص الجناح.

باستخدام الملقط ، انقل النصفين الأماميين النظيفين مع أقراص الجناح المرفقة إلى قطرة من وسط التصوير الحي النظيف مع وضع خطافات بين فواصل الشريحة. لعزل أقراص الجناح ، قم بتشريحها برفق من أغصان القصبة الهوائية الدقيقة بشفرة واحدة من ملقط التشريح أو سلك تنغستن ناعم مثبت على حامل إبرة تشريح. تخلص من الذبيحة المتبقية.

قم بتوجيه أقراص الجناح باستخدام شفرة ملقط تشريح أو إبرة تنغستن بحيث يكون جانب الغشاء المحيط متجها لأعلى. اضبط مستوى الصوت المتوسط بحيث يملأ البئر قليلا فوق مستوى الفاصل. قم بإزالة الدعامة الواقية العلوية من فاصل التصوير ، وقم بخفض انزلاق الغطاء برفق فوق العينة.

اضغط على انزلاق الغطاء عند نقاط التلامس المباعد باستخدام الطرف المستدير للملقط لضمان الالتصاق المناسب. لعرض مكدسات الصور في ImageJ، حدد Image، ثم Stacks، متبوعا ب Z Project، واختر Maximum Intensity من القائمة. في صور الإسقاط ذات الكثافة القصوى، حدد منطقة كيس الجناح بناء على نمط طي قرص الجناح باستخدام قناة الخطافات وأداة تحديد المضلع.

قم بتطبيق نفس التحديد على قناة GFP، وحدد تحرير متبوعا بمسح الخارج لإزالة الضوضاء خارج المنطقة المحددة. استخدم قناة الخطافات في صور العرض ذات الكثافة القصوى لتحديد النقاط الاصطناعية في صور GFP. ثم حدد المنطقة باستخدام أداة تحديد المضلع.

انقر فوق تحرير واختر مسح. في صور العرض ذات الكثافة القصوى التي تم تنظيفها، حدد تحليل، متبوعا بالرسم البياني، واختر قائمة للحصول على جميع قيم البكسل. انسخ هذه القائمة في جدول جداول بيانات.

لتعيين قيمة عتبة، قم بتحليل إشارة الخلفية في عينات التحكم السلبية وقم بتأكيد هذه القيمة باستخدام صور عينة أخرى. احسب النسبة المئوية للسطح الموجب GFP بقسمة عدد وحدات البكسل فوق العتبة على العدد الإجمالي لوحدات البكسل الصالحة وضرب النتيجة في 100. أخيرا ، قم بتطبيع كل قيمة محسوبة بعد تقسيمها على متوسط الشرط المرجعي ، والذي يتم تعيينه على واحد.

في الأقراص من النوع البري التي تفتقر إلى كل من مكونات GFP المنقسمة ، لوحظ فقط الحد الأدنى من التألق الذاتي GFP الحبيبي بالقرب من مركز كيس الجناح ، وتم استخدام إشارة خط الأساس هذه لتحديد عتبة التألق. أظهرت الأقراص التي تعبر فقط عن تقسيم CD4 GFP1-10 في الطبقة المناسبة للقرص مستويات مضان لا يمكن تمييزها عن النوع البري ، مما يؤكد الطبيعة غير الفلورية ل GFP1-10 وحدها. أدى التعبير المشترك عن CD4 الانقسام GFP1-10 في القرص المناسب و CD4spGFP11 في الغشاء المحيط إلى زيادة ملحوظة في بقع GFP المنفصلة والساطعة الموضعية في تجويف القرص ، مع مساحة مضان إيجابية أكبر بكثير فوق العتبة من الضوابط.

تسبب تعبير Slik في القرص المناسب في زيادة قوية في كثافة نوى الغشاء المحيط وارتفاع كبير في شدة إشارة GFP عبر منطقة كيس الجناح ، مما يشير إلى أن السيتونيم الناجم عن Slik ينشئ اتصالا معززا مع خلايا الغشاء المحيطة.