Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي

مرحبا ، اسمي ريك باسكوا ، طالب في مختبر هندسة الخلايا الجذعية هنا في قسم العلوم الكيميائية والحياتية في جامعة فرجينيا كومنولث. في هذا الفيديو ، سأوضح كيف يستخدم مختبرنا جهاز دوران STO غير مكلف وعصامي الصنع لإنشاء طبقة أحادية يمكن ملاحظتها من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لقياس علامات سطح الخلية. بالنظر إلى أن العديد من البروتوكولات الكيميائية المناعية يتم تكييفها مع h PSCs المزروعة في شرائح الغرفة حيث يمكن أن تنشأ مشاكل في المستعمرات في توصيف التعبير عن المؤشرات الحيوية على مستوى الخلية الفردية.

إن وجود الخلايا في طبقة واحدة لا يساعد فقط في التحليل البصري لهذه الخلايا ، ولكن ربما أيضا في تحديد تعبيرها ، يمكن إنشاء جهاز دوران الجيوب الأنفية الذي تستخدمه مختبراتنا باستخدام المواد الموجودة في معظم المختبرات يحتاج فقط إلى عينة خلية صغيرة ولا يحتاج إلى أي نوع من الكاشف المحدد. والأهم من ذلك ، أنها قادرة على إعادة إنتاج انتشار الخلايا المفردة بشكل موثوق للمراقبة. فيما يلي بعض الأشياء التي ستحتاجها لبناء جهاز السيتوزين.

الشرائح البلاستيكية ، نظرا لأن هذه ليست بالضرورة نظيفة ، يمكنك استخدام شرائح الغرفة القديمة إذا كنت ترغب في ذلك. شرائح زجاجية نظيفة مسبقا. يجب تنظيفها لأن هذا هو المكان الذي يتم فيه إنشاء الطبقة الأحادية للخلية.

ورق الترشيح ، أي نوع يجب أن يفعل ، ونصائح الماصة الصغيرة. من واحد إلى 10 نصائح ميكرولتر هي ما يستخدمه مختبرنا قبل بدء البناء. يجب أولا عمل ثقوب في الشرائح البلاستيكية.

يمكن القيام بذلك باستخدام مكبس الحفر. يعتمد قطر الثقوب على حجم طرف الماصة الدقيقة ويجب أن يكون حوالي عرض أوسع قسم من الطرف المستخدم في طرف واحد قياسي إلى 10 أطراف ماصة دقيقة. يجب أن يكون هذا عند حوالي سبعة ملليمترات.

كمية الثقوب التي تقوم بإنشائها في الشرائح البلاستيكية تماما على الاستخدام المقصود لها. بالنسبة للتلوين الكيميائي المناعي في مختبرنا ، على سبيل المثال ، نستخدم عادة فتحتين ، أحدهما للبقعة الإيجابية والآخر للتحكم السلبي في الخلفية. يمكن إعادة استخدام هذه الشرائح لعدد غير محدد من المرات.

بالنسبة لورق الترشيح ، ما عليك سوى قص قطعة منه إلى معلمات الشريحة البلاستيكية. استخدم فتحات الشريحة كمرجع لعمل ثقوب على ورق الترشيح. يجب أن يكون حجم الفتحة الموجودة على ورق الترشيح كبيرا بما يكفي بحيث يمكن أن يتناسب طرف الماصة الدقيقة بشكل مريح كما هو موضح هنا.

نحتاج بعد ذلك إلى قطع العدد المناسب من أطراف الماصات الدقيقة، واحدة لكل ثقب بنصف طولها تقريبا. سيكون هذا بمثابة قاعدة للشريحة الزجاجية حيث سيتم إنشاء الطبقة الأحادية الخلوية. بعد ذلك ، سيتم وضع ورق الترشيح فوق هذا.

سيعمل ورق الترشيح على امتصاص أي من الوسائط الزائدة من تلطيخ التعليق. سيتم بعد ذلك تعلوها الشريحة البلاستيكية التي ستكون بمثابة دعم قوي للأجهزة. يمكن بعد ذلك إغلاق هذا من جميع الجوانب الأربعة بشريط منزلي عادي.

أخيرا ، يتم بعد ذلك إدخال أطراف ماصة دقيقة كاملة في أطراف القطع للجهاز. سيكون هذا هو المكان الذي يتم فيه وضع العينات الخلوية بعد تلطيخ التعليق. قد يكون من المفيد أيضا تحديد مكان تشغيل أطراف القطع في الشريحة الزجاجية للتعرف بشكل أكثر ملاءمة.

يتضمن بروتوكول تلطيخ التعليق المناعي الكيميائي الذي يستخدمه مختبرنا الحصاد الأول للخلايا الجذعية في معلق خلية واحدة ، وعادة ما يتم ذلك عن طريق الإنزيمات ، باستخدام التربسين أو مخازن تفكك الخلايا غير الأنزيمية القائمة على EDTA. ثم يتم نقل الخلايا إلى مل واحد عبارة عن أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ووسط نموها القياسي. ثم يتم طرد المركزي عند 200 Gs لمدة أربع دقائق.

سيتم استخدام نفس سرعة الطرد المركزي لجميع خطوات الغسيل والدوران المترتبة على ذلك. ثم يتم شفط الوسط يدويا ، كن حذرا للغاية أثناء الشفط لضمان ترك حبيبات الخلية دون إزعاج. ثم يتم غسلها بمل واحد من PBS ، وتدور مرتين وتنتيح في كل مرة.

تتضمن الخطوة التالية إصلاح الخلايا باستخدام 4٪ من الكواشف الزوجية من الفورمالديهايد أو PFA اللازمة لعمل ذلك أو مدرجة في الكتابة المصاحبة لهذا الفيديو. يتم تحضين الخلايا في محلول الفورمالديهايد الزوجي بنسبة 4٪ وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. يوصى بتنفيذ هذه الخطوة قبل التعليق خارج الخلية ، والتلوين لاستخدام جهاز الدوران cyto.

بعد ذلك ، يتم غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة آثار PFA. يجب بعد ذلك حظر الخلية لمنع تلطيخ غير محدد. بعد غسل PBS في الخطوة السابقة ، قم بشفط الغسيل وأضف مل واحد من محلول الحظر.

يجب ترك هذا بعد ذلك في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة تقريبا. أثناء انتظار محلول الحجب ، يمكنك تحضير الجسم المضاد الأساسي عن طريق تخفيفه إلى محلول التخفيف والمنع الموصى به. قم بتخزين هذا عند أربع درجات مئوية.

بعد أن تكون الخلايا في محلول الانسداد لمدة 45 دقيقة تقريبا ، قم بالدوران والشفط وتعليقها في محلول الجسم المضاد الأساسي. لأغراض الكشف عن الربط غير المحدد والتحكم في الخلفية ، من الأفضل الاحتفاظ بعينة واحدة على الأقل كسالبة. لم يتم تطبيق أي جسم مضاد أولي وهو ببساطة إعادة التثبيت معلقة في PBS.

تترك جميع العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن ترك الخلايا الثابتة معلقة في محلول الجسم المضاد الأساسي طوال الليل وغسلها مرتين بمحلول مانع. يمكن صنع محلول الأجسام المضادة الثانوية أثناء الغسيل.

عادة ما تكون الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء ، لذلك إذا أمكن ، قم بتعتيم أضواء المختبر وتغطي أي حاويات مستخدمة بورق الألمنيوم ، ويتم ذلك لمنع التبييض الفلوري. يمكن دمج كواشف Antifa في البروتوكول ، ولكن يجب توخي الحذر في استخدامها لأنها يمكن أن تؤدي إلى خلفية أعلى مثل الجسم المضاد الأساسي المخفف إلى التركيز الموصى به في محلول الحظر. ضع واحدا على جميع العينات سواء تمت إضافته الأولية إليها أم لا بعد اكتمال الغسيل.

دع هذا يقف في منطقة مظلمة مثل داخل البرطمان لمدة ساعة تقريبا. اغسل الخلايا بمل واحد من محلول المنع مرتين. يجب أن تكون الخلية الآن جاهزة للتلوين النووي بصبغة DPI.

قم بإعداد محلول DPI عند تخفيف من واحد إلى 10 ، 000 في PBS في البداية ، واغسل الخلايا في مل واحد من PBS مرة واحدة ، ثم إعادة التدوير ، وتعليقها في نقطة في البوصة ، ودعنا نقف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. مثل الجسم المضاد الثانوي ، فإن DAPI حساس للضوء ، لذا قم بإجراء التعديلات اللازمة لمنع التألق والتبييض. اغسل مرة واحدة بمل واحد من PBS وأخيرا ، ريوس.

تعليق مرة أخرى في مل واحد PBS. يجب أن يكون هذا جاهزا للاستخدام مع جهاز دوران cyto. ضع 100 ميكرولتر كحد أقصى من محلول الخلية المفردة في الجزء العلوي من أطراف الماصات الدقيقة.

يوصى بكمية أقل لمنع الفائض أو التنقيط غير الضروري. بعد ذلك. ضع جهاز دوران cyto والميزان في جهاز طرد مركزي مكتبي وقم بالدوران لأسفل بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة أربع دقائق. بعد ذلك ، قم بتفكيك جهاز الدوران cyto بعناية بطريقة تقلل من فرصة إزاحة الخلايا من الشريحة الزجاجية.

تحقق من أن الوقوف قد حدث تحت المجهر الفلوري قبل التركيب. هذه صور تم التقاطها لطبقة أحادية من BG خلية V واحدة ملطخة بعلامات سطح الخلايا الأربعة SSCA من جهاز الدوران cyto. لاحظ مدى عزل الخلايا عن بعضها البعض ، مما يجعل ملاحظات الخلية المفردة والتسجيل ممكنا.

ما هو جيد في هذا البروتوكول هو أنه قادر على إعادة إنتاج خلايا أحادية الطبقة تكون مجدية وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف بسهولة مع أي تحليل روتيني لمزارع الخلايا الجذعية. مع ذلك ، أتمنى أن ترسم هذا الفيديو وتجد بروتوكول الاستخدام في بحثك الخاص.