Name: Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: تعلم تحليل الخلايا الجذعية البشرية المحفزة مناعياً باستخدام جهاز سايتوسبين عصامي. تُنشئ هذه الطريقة طبقة أحادية من الخلايا لتسهيل رصد وقياس علامات سطح الخلية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم توفير التمويل الجزئي لهذا العمل من قبل قوات الامن الوطني وظائف 0744556 (راو) وعلى منحة دراسية من خلال تعليم العلوم ، جامعة فرجينيا كومنولث HHMI وبرنامج البحث (باسكوال).

الجزء 1 : يلطخ تعليق Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد الخلايا في خلية واحدة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقل الخلايا في أنابيب microcentrifuge 1.5 2mL وطرد في 200G لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الخلايا التي طاف بها الشفط ، وإعادة معلقة في 1mL من برنامج تلفزيوني -- (بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 +) ثم طرد مرة أخرى في 200G لمدة 4 دقائق. وينبغي أن يتم ذلك مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسلها ، ثم يتم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في بارافورمالدهيد ٪ 1mL من 4 (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم غسلها مرتين مع الخلايا مرة أخرى 1mL من برنامج تلفزيوني -- </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل كتلة الخلايا ، من خلال إعادة تعليقها في 1mL من الحل بلوك (6 ٪ serum/94 PBS ٪ --). احتضان هذه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق ، ونضح من الحل بلوك. اعادة تعليق الخلايا في 1mL الضد من الحل الأساسي (كتلة مصنوعة من الحل في التخفيف مستحسن). يمكن أن تكون إما خلايا حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو على 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الشروع في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم غسلها مرتين مع الخلايا 1mL من الحل بلوك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك اعادة تعليق الخلايا في جسم 1mL حل الثانوية (مصنوعة من كتلة الحل في التخفيف الموصى بها) ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا ثم غسلها مرة أخرى مرتين مع 1mL من الحل بلوك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسله بمحلول بلوك ، يغسل خلايا مرة أخرى مع 1mL من برنامج تلفزيوني -- </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يغسل المختلفة ، وإعادة تعليق من الخلايا في 1mL دابي النووية وصمة عار (1:10،000 تخفيف دابي في برنامج تلفزيوني --) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5 دقائق ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق. نضح بها النووية دابي حل صمة عار والخلايا في اعادة تعليق 1mL من برنامج تلفزيوني -- </li></ol> الجزء 2 : إدراج hPSCs في الشرائح التي تتولد من خلال جهاز cytospin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد الشرائح البلاستيكية بجعل المبلغ المطلوب من الثقوب فيها مع الصحافة الحفر. القطر يجب أن يكون أكبر في معظم 1MM من أوسع قطرها غيض micropipette (ق) ليتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع الورق لتصفية المعلمات الشريحة من البلاستيك مع المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم إجراء ثقوب في ورقة الترشيح. ينبغي أن حجم الثقب (ق) أن تكون كبيرة بما يكفي التلميح micropipette (ق) يناسب سنججلي من خلال ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، وضعت واحدة من الشرائح البلاستيكية أعدت على أعلى شريحة زجاجية وضعت في أسفل ورقة تصفية قطع (الشكل 1). يتم تأمين طبقات مع الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع كحد أقصى 100μL (اعتمادا على الكثافة أحادي الطبقة المطلوب) لتعليق الخلية الملون من الجزء 1 الى الجزء العلوي من طرف micropipette (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر ، يمكن أن وزن الجهاز مع حل الخلية ، وخلق توازن مضاد لوزن مماثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن للجهاز cytospin ومكافحة ميزان ثم توضع في جهاز الطرد المركزي في سطح المكتب وطرد 200G لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، يتم تفكيكها بعناية جهاز cytospin بطريقة أن لا إزاحة الخلايا من شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا ، من الضروري زيادة PBS المحيطة بها -- على الجانب الزجاجي في يستنشق بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن عندئذ أن ينظر الخلايا باستخدام مجهر مضان للتحقق مما إذا تم تحقيق المونولاير الخلية المطلوبة. </li></ol> الجزء 3 : تركيب الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع قطرة من وسائل الإعلام المطلوب تركيب مباشرة في مركز كل منطقة تحتوي على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك يتم خفض بلطف زلة تغطية على الشرائح في محاولة لتجنب فقاعات الهواء إذا أمكن ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة الزائدة وسائل الاعلام متزايدة من الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك يتم اغلاق الجانبين من زلات مع تغطية طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الاحتفاظ الشرائح في منطقة مظلمة حتى يتم تخزين النتائج لوحظ وتوثيقها. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لأغراض مختبرنا ، يتم تخصيص طبق 35mm الثقافات الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة في الخلايا الليفية الماوس (MEFs) لإجراء تلطيخ immunocytochemical للاستخدام مع جهاز cytospin. ثم يتم جمع الخلايا من خلال الركض الأنزيمية ، وإزالة أكبر قدر من طبقة MEF ممكن ، في تعليق وحيد الخلية. إذا كان المطلوب أكثر من الخلايا الجذعية فعالة بمعزل عن طبقة MEF ، يمكن المستعمرات التقطت يدويا ثم هضمها في التعليق. إذا استخدمت ظروف التغذية الحرة في زراعة الخلايا الجذعية الثقافات ، يمكن ببساطة أن المستعمرات كش...

<table><tbody><tr><td>شرائح غرف Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>مادة للشرائح البلاستيكية المعاد استخدامها</td></tr><tr><td>شرائح مجهر Superfrost/Plus منظفة مسبقاً</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>رؤوس مرشحة 0.1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>غطاء زجاجي للمجهر</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>وسط تثبيت</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>مصل ماعز طبيعي</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد أحادي النسيلة Mouse Anti-SSEA-4</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>جسم مضاد أولي لصبغ SSEA-4</td></tr><tr><td>جسم مضاد أحادي النسيلة Rat Anti-SSEA-3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>جسم مضاد أولي لصبغ SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>جسم مضاد ثانوي لصبغ SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>جسم مضاد ثانوي لصبغ SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, Dihydrochloride</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز cytospin عصامي

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) هي مصادر الخلية مثيرة نظرا لقدراتها الذاتية التجديد لا حدود لها وقدرتها على التمايز إلى أنواع خلايا متعددة. عادة ما يتم تقييم حالة المحفزة للhPSCs بواسطة تقنيات مثل qPCR ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، وغيرها<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في الجسم الحي</emاستراتيجيات التمايز&gt; إلى أنواع خلايا متعددة. من بين هؤلاء ، وقد وضعت تقنيات immunocytochemical لتوصيف الروتينية للدولة غير متمايزة من hPSCs استنادا إلى تحليل المؤشرات الحيوية مرشح الخلايا والخلايا السطحية. نظرا لحقيقة أن تنمو hPSCs كمستعمرات ، تنشأ مشاكل في عملية التقييم الكمي والتعبير عن هذه العلامات على مستوى الخلية الفردية على أساس روتيني. تحليل التدفق الخلوي تعمل على معالجة هذه المسألة ولكنها تحتاج إلى أرقام الهواتف المحمولة واستخدام الكواشف التي لا تفضي عادة روتينية لمراقبة جودة تقييم الثقافات hPSC. وبالتالي ، فإن تطوير وسائل عملية وقابلة للتكرار في خلق عينات الخلايا المونولاير مع الحفاظ على سلامة لتقييم العلامة العديد من المزايا في مجال أبحاث الخلايا الجذعية. هذا التحليل immunocytochemical تفيد كثيرا لأنه يمكن من الخلايا الفردية المونولاير ملاحظتها بسهولة وكميا للتعبير عن علامات معينة. لتحقيق هذا الهدف ، تم إنشاء جهاز cytospin عصامي والأمثل للاستخدام مع تلوين immunocytochemical. وقد تم تحليل اثنين من سطح الخلية علامات (SSEA3/SSEA4) التعبير في خط BG01 البديل الخلايا الجذعية لأغراض هذا البروتوكول.

وقد تحقق تلطيخ تعليق immunocytochemical البشرية الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) عن سطح الخلية علامات (SSEA-3/SSEA-4) على أساس استخدام جهاز cytospin عصامي لإنشاء أحادي الطبقة من الخلايا للمراقبة والقياس الكمي.

Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي

تُعد الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs)، والتي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs)، خلايا مثيرة...

مرحباً، اسمي ريك باسكوا، طالب في مختبر هندسة الخلايا الجذعية هنا في قسم الكيمياء وعلوم الحياة بجامعة فيرجينيا كومنولث. سأوضح في هذا الفيديو كيف يستخدم مختبرنا جهاز تدوير STO منخفض التكلفة ومصنع ذاتياً لإنشاء طبقة أحادية مرئية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات من أجل قياس واسمات سطح الخلية. ونظراً لأن العديد من البروتوكولات الكيميائية المناعية مكيفة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (h PSCs) التي تنمو كمستعمرات في شرائح الغرف، فقد تظهر مشكلات عند توصيف تعبير المؤشرات الحيوية على مستوى الخلية الفردية.إن وجود الخلايا في طبقة أحادية لا يساعد في تحليلها بصرياً فحسب، بل قد يساعد أيضاً في تقدير كمية تعبيرها. يمكن تصنيع جهاز الساينوس سبين (sinus spin apparatus) الذي تستخدمه مختبراتنا باستخدام مواد متوفرة في معظم المختبرات، وهو لا يتطلب سوى عينة صغيرة من الخلايا ولا يحتاج إلى أي نوع من الكواشف المتخصصة. والأهم من ذلك، أنه قادر على إعادة إنتاج توزيع موثوق للخلايا المفردة بغرض الملاحظة. وفيما يلي بعض الأدوات التي ستحتاجها لتصنيع جهاز السيتوزين.شرائح بلاستيكية، وبما أنه ليس من الضروري أن تكون هذه الشرائح نظيفة، يمكنك استخدام شرائح غرف قديمة إذا رغبت في ذلك. شرائح زجاجية منظفة مسبقاً. يجب تنظيف هذه الشرائح لأنها ستكون الموضع الذي تُشكل فيه الطبقة الخلوية الأحادية.ورق ترشيح، يمكن استخدام أي نوع، ورؤوس ماصات دقيقة. تستخدم مختبراتنا رؤوس ماصات بسعة 1 إلى 10 µL قبل البدء في عملية التركيب. يجب أولاً عمل ثقوب في الشرائح البلاستيكية.يمكن القيام بذلك باستخدام مثقاب كهربائي (drill press). يعتمد قطر الثقوب على حجم طرف الماصة الدقيقة (micro pipette tip)، ويجب أن يكون مساوياً تقريباً لعرض أوسع جزء من الطرف المستخدم لماصة دقيقة قياسية بسعة 1 إلى 10 µL. يجب أن يكون هذا القطر حوالي سبعة مليمترات.تعتمد كمية الثقوب التي تنشئها في الشرائح البلاستيكية تماماً على الاستخدام المقصود منها. فبالنسبة للتلوين المناعي الكيميائي في مختبرنا، على سبيل المثال، نستخدم عادةً ثقبین، أحدهما للتلوين الإيجابي والآخر للتحكم في الخلفية السلبية. ويمكن إعادة استخدام هذه الشرائح لعدد غير محدود من المرات.بالنسبة لورق الترشيح، قم ببساطة بقص قطعة منه وفقاً لمقاييس الشريحة البلاستيكية. استخدم فتحات الشريحة كمرجع لعمل فتحات في ورق الترشيح. يجب أن يكون حجم الفتحة في ورق الترشيح كبيراً بما يكفي لتركيب طرف الماصة الدقيقة بإحكام كما هو موضح هنا.نحتاج بعد ذلك إلى قص العدد المناسب من رؤوس الماصات الدقيقة، بحيث يتم قص رأس واحد لكل ثقب عند منتصف طوله تقريبًا. سيعمل هذا كقاعدة للشريحة الزجاجية حيث سيتم تكوين الطبقة الخلوية الأحادية. بعد ذلك، يتم وضع ورق الترشيح فوق هذه القاعدة.ستعمل ورقة الترشيح على امتصاص أي فائض من الوسط الناتج عن صبغ المعلق. بعد ذلك، يتم وضع الشريحة البلاستيكية فوقها لتكون بمثابة الدعامة الصلبة للجهاز. ويمكن بعد ذلك إغلاق الجوانب الأربعة باستخدام شريط لاصق منزلي عادي.أخيرًا، يتم إدخال رؤوس الماصات الدقيقة الكاملة في الرؤوس المقطوعة من الجهاز. هذا هو الموضع الذي ستوضع فيه العينات الخلوية بعد عملية التلوين المعلق. وقد يكون من المفيد أيضًا تحديد موضع الرؤوس المقطوعة على الشريحة الزجاجية في البداية لتسهيل التعرف عليها.يتضمن بروتوكول صبغ المعلق الكيميائي المناعي الذي يستخدمه مختبرنا أولاً حصاد الخلايا الجذعية في معلق خلوي أحادي، ويتم ذلك عادةً عن طريق الهضم الإنزيمي باستخدام trypsin أو استخدام محاليل تفكيك الخلايا غير الإنزيمية القائمة على EDTA. ثم تُنقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1 ml أو 2 ml مع وسط نموها القياسي. بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي لهذه الأنابيب عند 200 Gs لمدة أربع دقائق.ستُستخدم سرعة الطرد المركزي نفسها في جميع خطوات الغسيل والترسيب اللاحقة. بعد ذلك، يتم سحب الوسط يدوياً، مع توخي الحذر الشديد أثناء السحب لضمان عدم تحريك كتلة الخلايا المترسبة. ثم تُغسل الكتلة بـ 1 ml من PBS مرتين، مع الترسيب وسحب السائل في كل مرة.تتضمن الخطوة التالية تثبيت الخلايا باستخدام محلول فورمالدهيد بتركيز 4% أو كواشف PFA، والمذكورة في الشرح المكتوب المصاحب لهذا الفيديو. تُحضن الخلايا في محلول الفورمالدهيد بتركيز 4% وتُترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ويُوصى بتنفيذ هذه الخطوة قبل عملية التعليق خارج الخلية، والتلوين المخصص لاستخدام جهاز الطرد المركزي السيبرينيتي (cyto spin apparatus).بعد ذلك، تُغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة بقايا PFA. يجب بعد ذلك حجب الخلايا لمنع التلوين غير النوعي. بعد عمليات الغسل بـ PBS في الخطوة السابقة، يتم سحب سائل الغسل وإضافة 1 ml من محلول الحجب.بعد ذلك، يجب ترك هذا المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة تقريباً. وأثناء انتظار محلول الحجب، يمكنك تحضير الجسم المضاد الأولي عن طريق تخفيفه إلى التركيز الموصى به باستخدام محلول الحجب. يُحفظ هذا المحلول عند درجة حرارة 4 °C.بعد ترك الخلايا في محلول الحجب لمدة 45 دقيقة تقريباً، قم بطردها مركزياً ثم اسحب المحلول وتخلص منه، وأعد تعليق الخلايا في محلول الأجسام المضادة الأولية. ولأغراض الكشف عن الارتباط غير النوعي والتحكم في الخلفية، يفضل الاحتفاظ بعينة واحدة على الأقل كعينة سالبة، حيث لا يتم تطبيق أي جسم مضاد أولي عليها ويتم ببساطة إعادة تعليقها في PBS.تُترك جميع العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريباً. وإذا رغب المستخدم في ذلك، يمكن ترك الخلايا المثبتة معلقة في محلول الجسم المضاد الأولي طوال الليل، ثم تُغسل مرتين باستخدام محلول الحجب. ويمكن تحضير محلول الجسم المضاد الثانوي أثناء عملية الغسيل.عادةً ما تكون الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء، لذا يُفضل خفض إضاءة المختبر وتغطية جميع الحاويات المستخدمة بورق الألومنيوم، وذلك لمنع تلاشي الفلورة. يمكن دمج كواشف Antifa في البروتوكول، ولكن يجب توخي الحذر عند استخدامها لأن ذلك قد يؤدي إلى زيادة الخلفية، تماماً كما هو الحال عند تخفيف الجسم المضاد الأولي إلى التركيز الموصى به في محلول الحجب. قم بتطبيق مؤشر واحد (vis) على جميع العينات، سواء تمت إضافة الجسم المضاد الأولي إليها أم لا، وذلك بعد اكتمال عملية الغسل.اترك هذا في منطقة مظلمة، كما هو الحال داخل وعاء، لمدة ساعة تقريبًا. اغسل الخلايا بـ 1 ml من محلول الحجب مرتين. يجب أن تكون الخلايا الآن جاهزة للتلوين النووي باستخدام صبغة DPI.قم بتحضير محلول DPI بتخفيف بنسبة 1 إلى 10,000 في محلول PBS في البداية، واغسل الخلايا في 1 ml من محلول PBS مرة واحدة، ثم أعد تعليقها في محلول dpi، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. وبما أن DAPI حساس للضوء تماماً مثل الأجسام المضادة الثانوية، فقم بإجراء التعديلات اللازمة لمنع تبييض الفلورة. اغسل مرة واحدة باستخدام 1 ml من محلول PBS، وأخيراً، أعد التعليق.أعد التعليق مرة أخرى في 1 ml من PBS. وبذلك يصبح المحلول جاهزاً للاستخدام مع جهاز الطرد المركزي الخلوي (cyto spin). ضع حداً أقصى قدره 100 µL من محلول الخلايا المفردة في الجزء العلوي من رؤوس الماصات الدقيقة.ومع ذلك، يُوصى باستخدام كمية أقل لمنع الفيضان أو التقطير غير الضروري. بعد ذلك، ضع جهاز الطرد المركزي الخلوي (cyto spin apparatus) والثقل الموازن في جهاز طرد مركزي مكتبي، وقم بالتدوير بسرعة 1000 RPM لمدة أربع دقائق. بعد ذلك، قم بتفكيك جهاز الطرد المركزي الخلوي بعناية وبطريقة تقلل من احتمالية إزاحة الخلايا عن الشريحة الزجاجية.تحقق من حدوث الترسيب باستخدام المجهر الفلوري قبل التثبيت. هذه صور التُقطت لطبقة أحادية من خلايا BG one V المصبوغة بـ SSCA four لعلامات سطح الخلية باستخدام جهاز الطرد المركزي الدوار (cyto spin). لاحظ مدى انعزال الخلايا عن بعضها البعض، مما يجعل ملاحظات وتسجيلات الخلية الواحدة أمراً ممكناً.تكمن ميزة هذا البروتوكول في قدرته على إعادة إنتاج طبقة أحادية من الخلايا بطريقة عملية وفعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتكيف بسهولة مع أي تحليل روتيني لمزارع الخلايا الجذعية. وبناءً على ذلك، آمل أن تستفيدوا من هذا الفيديو وأن تجدوا هذا البروتوكول مفيداً في أبحاثكم الخاصة.

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

كيمياء سيتولوجية مناعية قوية هو وسيلة لتحديد وجود والتطويع اللغوي التحت خلوية ، والوفرة النسبية للمستضد من الفائدة في الخلايا المستزرعة. يعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لمتابعة سلسلة من الخطوات التي من شأنها تمكين أحد الأجسام المضادة للحفاظ على والحصول على أقصى استفادة من تلطيخ واحد.

كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية

الخلايا الجذعية المحفزة المتنامي في تعليق تفرق في الهيئات مضغي الشكل (EBS). نحن هنا لشرح كيفية الحصول على جودة عالية cryosections EB مفيدة لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية لمرحلة التطور الجنيني ، مع الحفاظ على مؤسساتهم والمجاميع.

تحليل الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الأجهزة Cryosections مضغي الشكل

&lt; p class = "jove_content"&gt;يوضح هذا الفيديو فحصا لتوليد عضيات دماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يتم تحفيز iPSCs البشرية لتشكيل أجسام جنينية (EBs). يتم زراعة EBs فوق سقالة بوليمر باستخدام وسيط تحريضي ، مما يعزز التمايز إلى الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية والخلايا العصبية غير الناضجة. أخيرا ، يتم تضمين EBs في مصفوفة ونقلها إلى وسيط صيانة لتكوين العضيات الدماغية.

توليد العضيات الدماغية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية

هنا، نقدم طريقة لدينا أنشئت لإعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في iPSCs الإنسان خالية من التحوير مع فيروس سينداي، والذي يظهر نتائج متسقة وتعزيز الكفاءة.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمثل مصدرا للأنسجة المريض محددة للتطبيقات السريرية والبحوث الأساسية. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لإعادة برمجة الخلايا البشرية الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة في iPSCs مجانا الفيروسية باستخدام غير دمج-البلازميدات episomal.

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية هي مواقع معظم نقاط الاشتباك العصبي مثير في الثدييات قشرة الدماغ. يصف هذا الأسلوب التحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري في القشرية الخلايا العصبية الهرمية glutamatergic الإنسان المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة.

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لنشر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام الوسائط المكيفة فقط المشتقة من المشيمة البشرية في طبق مغطى بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSC.

ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يعد التوصيف المنتظم للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، للتأكد من الحفاظ على حالتها متعددة القدرات ، خطوة مهمة قبل استخدام هذه الخلايا لتطبيقات أخرى. هنا نصف طريقة للانتشار على نطاق صغير من iPSCs البشرية مصممة خصيصا لتمكين توصيفها السهل والروتيني عن طريق الكيمياء المناعية.

نشر على نطاق صغير iPSCs الإنسان في الظروف المصل خالية لتوصيف Immunocytochemical الروتينية

ويدخل هذا البروتوكول أسلوب خطوتين بسيطة لتمييز الخلايا الجذعية الظهارية حوفي القرنية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية تحت ظروف خالية من خلية ثقافة كرة-وتغذية. أساليب الثقافة الخلية المعروضة هنا تمكين إنتاج خلايا نوعية السريرية المنطبق على خلية القرنية العلاج باستخدام فعالة من حيث التكلفة، وعلى نطاق واسع.

فعالة وقابلة للتمايز الموجهة متوافقة سريرياً القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف 2D و 3D المستحثة بالإنسان الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hIPSC) القائمة على تطوير القشرة المخية الحديثة بالإضافة إلى منهجيات تكميلية تمكن من التحليل النوعي والكمي للنشأة الحيوية الأولية (PC) ووظيفتها.

2D و 3D المستحثة من قبل الإنسان نماذج الخلايا الجذعية متعددة القدرات القائمة على تشريح تورط سيليوم الأولية أثناء تطور القشرة المخية الجديدة

هنا ، نقدم بروتوكولا لنظام زراعة الخلايا الآلي. يقلل نظام الاستزراع الآلي هذا من العمالة ويفيد المستخدمين ، بما في ذلك الباحثين غير المعتادين على التعامل مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، من صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.

نظام استزراع آلي للحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وتمييزها

تعلم تحليل الخلايا الجذعية البشرية المحفزة مناعياً باستخدام جهاز سايتوسبين عصامي. تُنشئ هذه الطريقة طبقة أحادية من الخلايا لتسهيل رصد وقياس علامات سطح الخلية بدقة عالية.

Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي

استكشف المزيد من الفيديوهات