تحليل الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الأجهزة Cryosections مضغي الشكل

الجزء الأول ، مقدمة. مرحبا ، اسمي رافائيل. أنا باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر البروفيسور ستيفنز هانز في الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو في البرازيل.

مرحبا اسمي إسماعيل. أنا مساعد باحث ، وأستاذ. في هذا الفيديو ، سنوضح كيفية إعداد أقسام واضحة من أجسام Android.

لذلك دعونا نبدأ. الجزء الثاني ، المواد والمعدات. في هذا الإجراء ، سنحتاج إلى وسيط تضمين للعينات المجمدة.

4٪ محلول ألدهيد Paraform لتثبيت الخلايا ، محاليل السكروز للحماية بالتبريد. إبرة ذات طرف منحني قليلا ، ومجهر استريو لتصور أفضل ل EBS وشاكر. الجزء الثالث.

هنا يتم استزراع أجسام الأجنة البشرية في لوحات استزراع غير ملتصقة. باستخدام ماصة ، نقوم بتجميع جميع أجسام الأجنة بالقرب من بعضها البعض قدر الإمكان لنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. يتم حصاد EBS بعناية ونقله إلى الأنبوب.

من المهم جمع جميع ebs نظرا لعدم وجود كمية كبيرة من المواد بعد صب EBS ، يتم التخلص من وسائط الثقافة بعناية. يجب أن تكون قادرا على رؤية الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب. الآن يمكننا المضي قدما في إجراء التثبيت.

سيتم تثبيت EBS في محلول ألدهيد Paraform 4٪ في PBS أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات. من المهم إعادة تعليق الحبيبات بمحلول PFA. ثم يتم تثبيت EBS في محلول التثبيت لمدة 30 دقيقة.

بعد التثبيت ، تتم إزالة محلول PFA بعناية. مع الحرص على تجنب تعليق Resus ل EBS واستبداله بمحلول سكروز بنسبة 10٪ في PBS لبدء الحماية بالتبريد ل ebs ، يتم الاحتفاظ بالمادة لمدة 30 دقيقة في هذا المحلول. بعد ذلك ، نقوم بإزالة محلول السكروز بنسبة 10٪ بعناية وإعادة تعليق EBS في محلول سكروز بنسبة 20٪.

مرة أخرى ، يتم الاحتفاظ ب EBS لمدة 30 دقيقة في هذا المحلول. أخيرا ، تتم إزالة محلول السكروز بنسبة 20٪ واستبداله بمحلول سكروز بنسبة 30٪ في PBS حيث يتم الاحتفاظ به لمدة 30 دقيقة أخرى. الآن يمكننا المضي قدما في اتجاه وحظر ebs.

في مختبرنا ، نستخدم قذائف الكبسولة الفارغة كقوالب. من أجل حجب ebs ، من المهم تغطية الجدران الداخلية للطرف بمحلول السكروز قبل جمع ebs. الآن يمكننا جمع EBS بعناية والانتظار حتى يصب في أسفل الحافة.

بعد ذلك ، يتم وضع EBS في وسط الكتلة. يجب أن يكون هذا هو الموضع النهائي ل EBS داخل الكتلة. بمساعدة مجهر ستيريو وطرف ناعم ، نقوم بجمع وتفريغ أكبر قدر ممكن من محلول السكروز.

الحرص دائما على عدم جمع ebs. باستخدام إبرة ذات طرف منحني قليلا ، يتم وضع جميع EBS في وسط الكتلة. أخيرا ، يتم جمع محلول السكروز المتبقي بقطع من ورق الترشيح.

الموقع المحدد ل EBS داخل الكتلة مهما جدا للحصول على شرائح عالية الجودة. فيما يلي مثال على ضعف وضع EB داخل الغلاف. بعد وضع EBS وإزالة محلول السكروز ، تمتلئ القشرة ب OCT بدءا من الحواف ، مع الحرص دائما على تجنب تعليق Resus ebs.

تتم إزالة الفقاعات المتبقية باستخدام ماصة ، ويتم تحريك القشرة لمدة 15 دقيقة. بعد التحريض. يتم تجميد كتلة OCT في الثلج الجاف.

في هذه المرحلة ، يمكنك إما تخزين الكتلة الملفوفة بورق الألمنيوم عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من التحليل أو المتابعة إلى ناظم البرد الجزء الرابع ، القطع. لعمل أقسام التبريد ، ستحتاج إلى شفرة يمكن التخلص منها أو دائمة ، وشرائح زجاجية معالجة مسبقا OCT و Poly L lysine. تتم إزالة كتلة OCT من الفريزر وحفظها داخل ناظم البرد حتى تصل درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر.

ثم يتم وضع الكتلة على الحامل ومحاذاة بالتوازي مع حافة الشفرة. عينات EB أصغر بكثير من معظم عينات الأنسجة الأخرى ، لذلك من المهم جدا التأكد من أن سطح الكتلة بالكامل يلامس الشفرة في نفس الوقت ، وبالتالي تقليل فقد المواد. بعد وضعها ، يتم تقطيع الكتلة إلى شرائح بحجم 10 ميكرومتر ، ويتم جمعها مباشرة على الشرائح الزجاجية.

يمكن تخزين الشرائح ، ويفضل أن تكون عند درجة حرارة 70 درجة مئوية تحت الصفر ، أو يمكن استخدامها أيضا في نفس اليوم. قد تكون المادة ملطخة للكيمياء المناعية أو التألق المناعي. استنتاج. توفر الطريقة الموضحة هنا بروتوكولا غير مكلف بشكل معقول وسهل المتابعة للحصول على أقسام رقيقة من أجسام الأجنة تم تطويرها من سلالات الخلايا الجذعية البشرية H تسعة أو الفأر US P واحد.

يمكن استخدام أقسام التبريد الناتجة في مجموعة متنوعة من الإجراءات من أجل تحليل تعبير البروتين أو مورفولوجيا EB.