تحليل الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الأجهزة Cryosections مضغي الشكل
ديسمبر 8, 2010
الخلايا الجذعية المحفزة المتنامي في تعليق تفرق في الهيئات مضغي الشكل (EBS). نحن هنا لشرح كيفية الحصول على جودة عالية cryosections EB مفيدة لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية لمرحلة التطور الجنيني ، مع الحفاظ على مؤسساتهم والمجاميع.
الجزء الأول ، مقدمة. مرحبا ، اسمي رافائيل. أنا باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر البروفيسور ستيفنز هانز في الجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو في البرازيل.
مرحبا اسمي إسماعيل. أنا مساعد باحث ، وأستاذ. في هذا الفيديو ، سنوضح كيفية إعداد أقسام واضحة من أجسام Android.
لذلك دعونا نبدأ. الجزء الثاني ، المواد والمعدات. في هذا الإجراء ، سنحتاج إلى وسيط تضمين للعينات المجمدة.
4٪ محلول ألدهيد Paraform لتثبيت الخلايا ، محاليل السكروز للحماية بالتبريد. إبرة ذات طرف منحني قليلا ، ومجهر استريو لتصور أفضل ل EBS وشاكر. الجزء الثالث.
هنا يتم استزراع أجسام الأجنة البشرية في لوحات استزراع غير ملتصقة. باستخدام ماصة ، نقوم بتجميع جميع أجسام الأجنة بالقرب من بعضها البعض قدر الإمكان لنقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. يتم حصاد EBS بعناية ونقله إلى الأنبوب.
من المهم جمع جميع ebs نظرا لعدم وجود كمية كبيرة من المواد بعد صب EBS ، يتم التخلص من وسائط الثقافة بعناية. يجب أن تكون قادرا على رؤية الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب. الآن يمكننا المضي قدما في إجراء التثبيت.
سيتم تثبيت EBS في محلول ألدهيد Paraform 4٪ في PBS أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات. من المهم إعادة تعليق الحبيبات بمحلول PFA. ثم يتم تثبيت EBS في محلول التثبيت لمدة 30 دقيقة.
بعد التثبيت ، تتم إزالة محلول PFA بعناية. مع الحرص على تجنب تعليق Resus ل EBS واستبداله بمحلول سكروز بنسبة 10٪ في PBS لبدء الحماية بالتبريد ل ebs ، يتم الاحتفاظ بالمادة لمدة 30 دقيقة في هذا المحلول. بعد ذلك ، نقوم بإزالة محلول السكروز بنسبة 10٪ بعناية وإعادة تعليق EBS في محلول سكروز بنسبة 20٪.
مرة أخرى ، يتم الاحتفاظ ب EBS لمدة 30 دقيقة في هذا المحلول. أخيرا ، تتم إزالة محلول السكروز بنسبة 20٪ واستبداله بمحلول سكروز بنسبة 30٪ في PBS حيث يتم الاحتفاظ به لمدة 30 دقيقة أخرى. الآن يمكننا المضي قدما في اتجاه وحظر ebs.
في مختبرنا ، نستخدم قذائف الكبسولة الفارغة كقوالب. من أجل حجب ebs ، من المهم تغطية الجدران الداخلية للطرف بمحلول السكروز قبل جمع ebs. الآن يمكننا جمع EBS بعناية والانتظار حتى يصب في أسفل الحافة.
بعد ذلك ، يتم وضع EBS في وسط الكتلة. يجب أن يكون هذا هو الموضع النهائي ل EBS داخل الكتلة. بمساعدة مجهر ستيريو وطرف ناعم ، نقوم بجمع وتفريغ أكبر قدر ممكن من محلول السكروز.
الحرص دائما على عدم جمع ebs. باستخدام إبرة ذات طرف منحني قليلا ، يتم وضع جميع EBS في وسط الكتلة. أخيرا ، يتم جمع محلول السكروز المتبقي بقطع من ورق الترشيح.
يعدالموقع المحدد ل EBS داخل الكتلة مهما جدا للحصول على شرائح عالية الجودة. فيما يلي مثال على ضعف وضع EB داخل الغلاف. بعد وضع EBS وإزالة محلول السكروز ، تمتلئ القشرة ب OCT بدءا من الحواف ، مع الحرص دائما على تجنب تعليق Resus ebs.
تتم إزالة الفقاعات المتبقية باستخدام ماصة ، ويتم تحريك القشرة لمدة 15 دقيقة. بعد التحريض. يتم تجميد كتلة OCT في الثلج الجاف.
في هذه المرحلة ، يمكنك إما تخزين الكتلة الملفوفة بورق الألمنيوم عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من التحليل أو المتابعة إلى ناظم البرد الجزء الرابع ، القطع. لعمل أقسام التبريد ، ستحتاج إلى شفرة يمكن التخلص منها أو دائمة ، وشرائح زجاجية معالجة مسبقا OCT و Poly L lysine. تتم إزالة كتلة OCT من الفريزر وحفظها داخل ناظم البرد حتى تصل درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية تحت الصفر.
ثم يتم وضع الكتلة على الحامل ومحاذاة بالتوازي مع حافة الشفرة. عينات EB أصغر بكثير من معظم عينات الأنسجة الأخرى ، لذلك من المهم جدا التأكد من أن سطح الكتلة بالكامل يلامس الشفرة في نفس الوقت ، وبالتالي تقليل فقد المواد. بعد وضعها ، يتم تقطيع الكتلة إلى شرائح بحجم 10 ميكرومتر ، ويتم جمعها مباشرة على الشرائح الزجاجية.
يمكن تخزين الشرائح ، ويفضل أن تكون عند درجة حرارة 70 درجة مئوية تحت الصفر ، أو يمكن استخدامها أيضا في نفس اليوم. قد تكون المادة ملطخة للكيمياء المناعية أو التألق المناعي. استنتاج. توفر الطريقة الموضحة هنا بروتوكولا غير مكلف بشكل معقول وسهل المتابعة للحصول على أقسام رقيقة من أجسام الأجنة تم تطويرها من سلالات الخلايا الجذعية البشرية H تسعة أو الفأر US P واحد.
يمكن استخدام أقسام التبريد الناتجة في مجموعة متنوعة من الإجراءات من أجل تحليل تعبير البروتين أو مورفولوجيا EB.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه المقالة عملية الحصول على شرائح ثلجية عالية الجودة من أجسام جنينية (EBs) مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المزروعة في تعليق. تعتبر هذه الشرائح الثلجية ضرورية لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية للجنينية مع الحفاظ على تنظيم الأجسام الجنينية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الجنينية
- التمايز الخلوي
الخلفية
- يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
- الأجسام الجنينية هي تجميعات تحاكي تطور الجنين المبكر.
- دراسة الأجسام الجنينية تساعد في فهم آليات الجنينية.
- الشرائح الثلجية عالية الجودة ضرورية للتحليل المفصل.
هدف الدراسة
- لتوفير طريقة لتحضير شرائح ثلجية من الأجسام الجنينية.
- لتسهل دراسة العمليات الخلوية والجزيئية أثناء التمايز.
- للحفاظ على التنظيم البنيوي للأجسام الجنينية في التحليل.
الطرق المستخدمة
- تحضير الخلايا الجذعية متعددة القدرات في زراعة معلقة.
- تحريض التمايز إلى أجسام جنينية.
- تقنيات التشريخ الثلجي للحصول على عينات عالية الجودة.
- تحليل الخصائص الخلوية والجزيئية للأجسام الجنينية.
النتائج الرئيسية
- تحضير ناجح للشرائح الثلجية من الأجسام الجنينية.
- الحفاظ على تنظيم الأجسام الجنينية في الشرائح الثلجية.
- قدرة محسنة على دراسة الجنينية على المستوى الخلوي.
- يمكن تطبيق الطريقة الموضحة في سياقات بحثية مختلفة.
الاستنتاجات
- تسمح الطريقة بتحليل مفصل للأجسام الجنينية.
- الشرائح الثلجية عالية الجودة قيمة للدراسات الجنينية.
- يمكن أن تتقدم هذه الطريقة في فهم تمايز الخلايا الجذعية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
