كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان بفيروس سينداي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الخلايا الليفية وتصفيحها أولا ليتم نقلها. الخطوة التالية من الإجراء هي إصابة الخلايا بفيروس سينداي.

ثم يتم نقل الخلايا الليفية المصابة إلى خلايا مغذية الخلايا الليفية الجنينية للفأر الجديد. الخطوة الأخيرة هي اختيار المعاد برمجته يدويا. الآن الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، في النهاية إعادة برمجة خلايا الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الليفية ، دون استخدام الجينات العابرة ، يمكن إظهارها من خلال وضع العلامات المناعية و R-T-P-C-R.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية هي أنها تعزز كفاءة إعادة البرمجة دون الاستمرار في العبور وبطريقة فعالة من حيث التكلفة لهذا البروتوكول ، قم بإعداد الخلايا الليفية البشرية المستزرعة في DMEM. مع FBS ، تنقل هذه الخلايا إلى 24 لوحة بئر للوحة التجربة ، يتم نقل الخلايا في ستة تخفيفات تسلسلية لتحديد أفضل كثافة لربط الخلية. يمكن أن يستوعب كل صف من صفيحة 24 بئر سلسلة تخفيف واحدة من الخلايا.

وبالتالي يمكن اختبار أربعة أنواع من الخلايا على لوحة واحدة ، واحتضان التخفيف لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، حدد الآبار على ثلاثة مستويات من التقاء التنبيغ. واحد عند مستوى عال من 80 إلى 90٪ التقاء ، وواحد عند حوالي 60٪ التقاء ، والثالث عند حوالي 30٪ التقاء قبل ساعة أو أكثر من التنبيغ.

استبدل الوسائط ب 300 ميكرولتر من وسائط الخلايا الليفية الطازجة لإذابة الجليد. مجموعة واحدة من أنابيب فيروس سينداي عند 37 درجة مئوية لبضع ثوان ، ثم تنتهي. إذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة.

بالطرد المركزي للفيروسات المذابة عند 6,000 جم لمدة 10 ثوان وقم بتخزينها على الجليد في أنبوب واحد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. اصنع مزيجا من الفيروسات محسوبا وفقا لعدد الخلايا المراد نقلها. يمكن العثور على تفاصيل الحساب في بروتوكول النص.

امزج الفيروسات جيدا مع سحب العينة اللطيف. الآن إلى الخلايا الأكثر كثافة ، أضف مجلدين من الفيروسات. أضف حجما واحدا من الفيروس إلى خلايا الكثافة المتوسطة وأضف نصف حجم الفيروس إلى التحديد الأقل كثافة.

قم بتدوير الطبق واتركه يحتضن طوال الليل حتى يحدث رد الفعل في اليوم التالي. استبدل الوسائط ب 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا الليفية الطازجة. افعل ذلك مرة أخرى بعد يومين ، بعد ثلاثة أيام من تغيير الوسائط الثاني الذي تم إجراؤه على الخلايا المنقولة.

تحضير خلايا الميثامفيتامين في أطباق 60 ملم مع DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS 500،000 خلية لكل طبق واحتضانها طوال الليل. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط الموجودة على خلايا الميثامفيتامين بوسائط جديدة ثم تابع إعداد الزراعة المشتركة. أولا ، قم بإزالة الوسائط من الخلايا الليفية المنقولة واغسلها مرة واحدة باستخدام DPBS.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى كل بئر متحول من الخلايا في غضون خمس دقائق. اجمع جميع الخلايا المنفصلة في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلترا. قم بتدوير الخلايا عند 1 ، 350 جم لمدة أربع دقائق.

ثم قم بإزالة المادة الطافية واغسل الخلايا المحببة بحوالي خمسة ملليلتر من الوسط الطازج لتحييد التريبين. الآن اجمع الخلايا بدوران أربع دقائق أخرى عند 1 ، 350 G. معظم الخلايا على شكل ستة تخفيفات متسلسلة في الميثامفيتامين.

قد لا تكون هناك حاجة إلى التخفيفات الأولى والأخيرة اعتمادا على معدل موت الخلايا. احتفظ ببعض الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي واحتضان الألواح طوال الليل. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسائط ES بشرية مكملة ب 10 ميكرومولار من مثبط RO kinase Y 2 7 6 3 2.

لتحسين بقاء الخلية خلال الأيام التالية ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط ES البشرية المكملة ب unsu. بعد أسبوع من الزراعة ، ابدأ في فحص الأطباق كل بضعة أيام بحثا عن تكوين مستعمرة ES مثل كتل الخلايا. بمجرد ظهورها ، راقب النمو.

بعد ثلاثة أسابيع من التنبيغ ، يجب أن تكون مستعمرات كتل الخلايا الجنينية جاهزة للتوسع. أعدت خلايا تغذية الميثامفيتامين في 24 لوحا جيدا تماما كما تم تحضيرها لألواح 60 ملم. قبل اختيار أي مستعمرات ، قم بتغيير الوسائط الموجودة على خلايا الميثامفيتامين إلى وسائط ES مع 10 ميكرولترات من Y 2 7 ، 6 ، 3 ، 2.

اختر مستعمرة واحدة في كل مرة من الأطباق. انقل المستعمرة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر مع محلول هناك. تفكيك المستعمرة باستخدام الماصة.

ثم قم بتغطية واحد مني. حسنا مع المستعمرة المفككة. في النهاية قم بتحميل كل بئر بمستعمرة واحدة مفككة وقم بتحميل أكبر عدد ممكن من الآبار.

حافظ على الخلايا مع تغييرات الوسائط اليومية وقم بتوسيعها إلى ستة أطباق جيدة ثم أطباق 60 ملم. عادة ، لا تظهر الخلايا الليفية المصابة بفيروس سينداي أي تغييرات مورفولوجية إلا بعد خمسة أيام. ثم تأخذ الخلايا شكلا دائريا مع نواة أكبر وسيتوبلازم أصغر.

يتضمن هذا البروتوكول صغير الحجم العديد من المعلمات التي يمكن تحسينها ، مثل كثافة الخلايا الليفية ، وعيار الفيروس ، وكثافة الطلاء إلى mes. يمكن أيضا تحسين نقل الخلايا بطلاقة مختلفة موضحة بألوان مختلفة. بعد أسبوع من الزراعة المشتركة مع الخلايا المغذية للميثامفيتامين ، يكون للأرومات الليفية المعاد برمجتها جزئيا شكل فضفاض ويمكن قطفها بسهولة بدلا من جمعها باستخدام التربسين.

معاد برمجتها بالكامل ، يمكن التعرف بوضوح على الخلايا المعاد برمجتها جزئيا. يتم تعبئة الخلايا المعاد برمجتها بالكامل بإحكام ويمكن أن يكون للمستعمرات حدود واضحة. تصنع الخلايا المعاد برمجتها جزئيا مجموعات فضفاضة يمكن فصلها بسهولة.

بعد توسيع استنساخ IPSC لعدة أسابيع ، هناك ما يبرر تلطيخ علامات الخلايا الجذعية مقارنة بخلايا H التسع. تعتبر IPCs إيجابية للعديد من الأجسام المضادة المتوقعة ، بما في ذلك SSEA four و OCT four و TRA 81 و nano G التي تدعم جودتها متعددة القدرات. لم يلاحظ استخدام التعبير الجيني المعدل R-T-P-C-R في استنساخ IPSC البشري.

بعد 10 بادئات ل OCT الخارجية أربعة ، تم استخدام SOX two و klf four و Cmic مع عينات تحكم إيجابية أظهرت مستويات قوية من التعبير الجينات المعدلة وراثيا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة برمجة الخلايا الجسدية لتحفيز الخلايا الجذعية متعددة القوة وكيفية اختيارها ، وإعادة برمجة الخلايا من الخلايا الأخرى بالكامل.