تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الشكل العام لمجمعات البروتين. يتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على بيانات حركة الحديد لقياس الطيف الكتلي لأيونات مركب البروتين وقياس قيم وقت الانجراف لكل حالة شحنة. كخطوة ثانية ، يتم التحقق من صحة الظروف التجريبية من أجل ضمان قياسات التنقل لهياكل البروتين الأصلية.

بعد ذلك ، ترتبط قيم وقت الانجراف المقاسة بمناطق المقطع العرضي. تحدد النتائج قيم المقطع العرضي للتصادم للبروتينات أو مجمعات البروتين ذات الهياكل ثلاثية الأبعاد غير المعروفة. توفر هذه المعلومات أدلة على شكلها العام وتعبئة الوحدات الفرعية والمخطط.

مرحبا ، أنا إسحاق ليسكي من مختبر ميكروفون ، قسم الكيمياء البيولوجية في معهد وايزمان للعلوم ، وأنا نام كيرشينباوم أيضا من مختبر مي. سنعرض اليوم إجراء قياس مجمعات البروتين المقطعية التصادمية باستخدام قياس الطيف الكتلي الهجين وأدوات حركة الحديد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الشكل العام والتنظيم العام لمجمعات البروتين.

لذلك دعونا نبدأ. يركز هذا الإجراء على حركة الحديد أو قياس الطيف الكتلي أو تحليل IMM MS لمجمعات البروتين. يتم توضيح خطوات تحضير العينة ومعايرة الجهاز وإجراءات تحسين MS و MS الترادفي في بروتوكول JO ذي الصلة.

بشكل عام ، يتضمن هذا البروتوكول تركيزات ميكرومولار منخفضة من المركب في مخزن مؤقت متطاير مثل أسيتات الأمونيوم. بالنظر إلى أنه يتم استهلاك واحد إلى اثنين من ميكرولتر لكل شعيرات دموية تدفق نانو ، قم بإعداد 10 إلى 20 ميكرولترا كحد أدنى للحجم لتمكين تحسين ظروف مرض التصلب العصبي المتعدد. لبدء هذا الإجراء ، اضبط الموجة المتنقلة أو المشبك الموجة T IMMS على الأوضاع التالية لتنقل العملية حيث يتم ضبط الموجة الثلاثية والضغوط تلقائيا لكل من المراسلة الفورية ووقت الرحلة لفصل الأيونات ، واكتساب الأيونات الموجب ووضع V ، وتعيين مسار الأيونات عبر أنبوب الطيران والانعكاس على تشغيل جميع الغازات هنا.

يستخدم النيتروجين لفصل الحقائب العضوية والأرجون لمناطق المصيدة والنقل. القيم الأولية الموصى بها هي تدفق غاز قدره 24 مل في الدقيقة لجهاز IMS و 1.5 مل في الدقيقة لمنطقة المصيدة بعد ذلك ، قم بتعيين نطاق اكتساب نسبة شحنة الصاري لمركب بروتين غير معروف.

استخدم نطاقا واسعا للكتلة في البداية ، والذي يمكن تقليله بعد ذلك إلى القيم المطلوبة ، واضبط ملف تعريف MS وفقا لذلك. للحصول على أقصى قدر من كفاءة الإرسال للمجمعات الكبيرة ، يجب ضبط نطاق كتلة الاكتساب من نسبة شحن 1030 2000 مللي أمبير وملف تعريف MS إلى تلقائي. خلاف ذلك ، يمكن تعيين ملف التعريف وفقا للرسم البياني المعروض.

تحقق من إعداد التردد اللاسلكي وإذا لزم الأمر ، اضبط على القيم المناسبة لمجمعات البروتين الكبيرة كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة ، وقم بتطبيق الجهد الشعري وضغط تدفق النانو المنخفض. بمجرد بدء البخاخات ، حاول تقليل ضغط تدفق النانو إلى الحد الأدنى.

بالإضافة إلى ذلك ، اضبط موضع الشعيرات الدموية فيما يتعلق بالمخروط ، واضبط معلمات اكتساب MS من أجل الحصول على طيف MS الذي تم حله جيدا. قم بتحسين تدرج الضغط على طول الجهاز ومخروط أخذ العينات ، بالإضافة إلى الإعدادات المحتملة لمصيدة انحياز مخروط الاستخراج ونقلها كما هو مفصل في بروتوكول JoVE المرتبط. على الرغم من أن هذه المعلمات تعتمد على العينة الموضحة ، إلا أن هذه هي الشروط المستخدمة للحصول على أطياف MS لكتل الحديد المختلفة من الببتيد إلى مجمعات البروتين.

تتطلب الأيونات الكبيرة طاقات تصادم أعلى وجهد تحيز. يوصى أيضا بزيادة الضغط الخلفي لتحليل مجمعات البروتين الكبيرة لتقليل تنشيط المجمع. حاول التقليل تدريجيا بخطوات تبلغ حوالي 10 فولت ، واستخراج مخروط العينة ، والمصيدة المخروطية ، والفولتية المتحيزة دون تغيير موضع الذروة.

بمجرد الحصول على طيف الكتلة الأمثل ، يجب ضبط وقت الانجراف أو ملف تعريف المراسلة الفورية عند تحليل تجميعات البروتين. غالبا ما تكون الظروف المثلى لكل من قياسات الكتلة والحركة غير متوافقة. لذلك ، من المهم تحقيق التوازن المناسب بين الاثنين.

بشكل عام ، يجب تحسين مخطط التنقل الحديدي بحيث يتم توزيع القمم على النطاق الزمني للانجراف بأكمله ويكون ملف تعريف الذروة سلسا. يمكن أن يرتبط الاقتراب من عدم تناسق الذروة الكبير بضعف الفصل بين المطابقات المتعددة ، ويمكن ضبط سرعة الموجة T ، وارتفاع الموجة T ، ومعدل تدفق غاز IMS لتحسين فصل التنقل. تؤدي زيادة سرعة الموجة T إلى توسيع ملف توزيع وقت الانجراف.

في حين أن قيم ارتفاع الموجة T المتزايدة تضييق بالمثل ، مما يؤدي إلى زيادة تدفق غاز IMS بدءا من 10 ملليلتر في الدقيقة كحد أدنى ، مما يؤدي إلى تحويل ملف تعريف وقت الانجراف نحو قيم أعلى يعمل على تحسين طيف حركة الحديد. من خلال تحديد اثنين من المتغيرات الثلاثة وتحسين الثالث ، اضبط سرعة الموجة T على 250 مترا في الثانية وتدفق الغاز إلى 24 مليلترا في الدقيقة. ثم كنقطة انطلاق ، اضبط الارتفاع على ثلاثة فولت وبطريقة تدريجية ، قم بزيادته بزيادات فولت واحدة.

عند استخدام الفولتية عالية التحيز ، يوصى بتقليل ضغط غاز IMS وبهذه الطريقة تمكين انخفاض جهد التحيز. نتيجة لذلك ، سيتم تقليل التنشيط والتفكك المعقد. يمكن أن يظهر تأثير الانقلاب عندما لا يتم تحسين الظروف ، ويتم ملاحظته كذروة متطابقة في الجزء الأول من طيف أوقات الانجراف وحافة المخلفة.

عندما لا تعبر الأيونات عبر جهاز IAM ، فقد تستغرق رحلتها بشكل فعال وقتا أطول من الوقت المطلوب لإطلاق العبوة الحديدية التالية في خلية التنقل. نتيجة لذلك ، يتم إطلاق مجموعة جديدة من الأيونات من منطقة المصيدة قبل تسليم الحزمة السابقة إلى منطقة الدافع. للتخلص من هذه القطعة الأثرية ، قم بزيادة ارتفاع الموجة T وتقليل سرعة الموجة T وضغط IMS.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل وقت تحرير المصائد. علاوة على ذلك ، من المهم التحقق من أن ارتفاع موجة T للنقل مضبوطة على خمسة فولت على الأقل. أيضا لمنع تسرب الأيونات نحو خلية IMS.

يجب الحفاظ على ارتفاع مصيدة التنقل عند أقصى المستويات. قد تؤدي السرعة المنخفضة والسعة العالية لموجات T للانتقال إلى تموج ملف توزيع وقت الانجراف. تحدث هذه القطعة الأثرية عندما لا يتم الحفاظ على الفصل المتحرك للأيونات من خلال مناطق النقل والصلبة بسبب التزامن الجزئي بين تردد pusha وسرعة الموجة T للنقل.

للقضاء على هذا التأثير ، يجب ضبط وقت الدافع أو سرعة الموجة T للنقل. نظرا لأن تردد pusha مرتبط بنطاق الكتلة ، فقد تظهر هذه القطعة الأثرية مرة أخرى. عند تغيير هذه المعلمة.

ارتفاع الموجة T له تأثير طفيف. على الرغم من أن تقليله قد يساعد أيضا في القضاء على التموجات. بمجرد تحسين المعلمات المذكورة أعلاه ، يمكن الحصول على بيانات IMMS لتحقيق حل عالي.

العصيبة. غالبا ما يتم تنشيط مجمعات بروتين القمم داخل مطياف الكتلة لتعزيز تجريد المياه المتبقية والمكونات العازلة. ومع ذلك ، إذا زادت طاقة التنشيط إلى ما بعد قيمة العتبة ، يمكن أن يحدث التكشف الجزئي لتشكيل حالات وسيطة متعددة ، والتي من غير المرجح أن تتوافق مع بنية حالة الحل الأصلي. نتيجة لذلك ، قد يتم تغيير ذروة وقت الانجراف وتوسيعها مما يعكس السكان الهيدروجينيين للهياكل غير المكشوفة.

من أجل الحصول على بيانات وقت الانجراف المتوافقة مع هياكل طور الحل ، من الضروري التحكم بعناية في الفولتية المستخدمة لتسريع الأيونات قبل فصل التدفق الفوري ، وبالتالي زيادة الجهد الشعري والمخروطي بطريقة تدريجية مع مراقبة التأثير على طيف وقت الانجراف. علاوة على ذلك ، للحصول على دقة MS العالية ، يفضل زيادة النقل بدلا من جهد المصيدة. يتم وضع جهاز المراسلة الفورية أولا متبوعا بمنطقة النقل ومحلل OF.

نظرا لأن التنشيط يتبع قياس المراسلة الفورية ، فإنه يظل غير متأثر للمراسلة الفورية ، بينما يمكن زيادة دقة MS لضمان الحصول على البيانات في ظل ظروف تحافظ على البنية الأصلية للمجمع ، فمن المهم جمع البيانات عبر مجموعة من الظروف التجريبية والحلول بدلا من الالتزام بمجموعة واحدة محسنة من المعلمات. لهذا السبب ، قم بزيادة جهد تصادم المصيدة بطريقة تدريجية واحصل على البيانات على فترات 10 فولت مع مراقبة التأثير على ملف تعريف حركة الحديد. أخيرا ، لتحديد التأكيدات المكشوفة وتقييم البيانات المكتسبة يدويا ، تحفز تفكك مركب البروتين عن طريق معايرة العينة بحمض الأسيتيك على مدى الأس الهيدروجيني من اثنين إلى سبعة وتسجيل البيانات ، ومتابعة تحليل البيانات في نظام IMS للموجة T ، ومناطق المقطع العرضي المحددة بواسطة نهج معايرة وقت الانجراف ، استخدام بروتينات Cain ذات قيم المقطع العرضي المعروفة.

أولا ، قم بإعداد محاليل بروتين من العيار المشوه بسعة 10 ميكرومولار لكل منها. استخدم السيتوكروم C الحصان وعضل القلب واليوبيكويتين البقري في 49 ، 49 0.2 نسبة حجم حمض الميثانول الخليك المائية. بعد ذلك ، احصل على بيانات IMMS لبروتينات العيار في ظل نفس ظروف الأداة المستخدمة تماما للبروتين المستهدف أو مركب البروتين ، وحافظ على جميع الفولتية وقيم الضغط متطابقة للحفاظ على إعدادات فصل المراسلة الفورية.

بعد الحصول على البيانات ، استخرج قيمة وقت الانجراف التجريبي لكل شحنة. تقوم حالة بروتينات Cain بتصحيح كل من أوقات الانجراف من العيار T prime D باستخدام المعادلة التالية حيث MOVZ هي نسبة الشحنة الرئيسية للأيون المرصود ، و C هي معامل تأخير EDC لدورة العمل المحسنة. تعتمد قيمته عادة بين 1.4 و 1.6 على الأداة.

يشار إلى قيمة EDC داخل إعدادات الاستحواذ على النظام ، علامة تبويب إعداد اكتساب واحدة ، وتصحيح كل مقطع عرضي من العيار لكل من حالة شحنة الحديد والكتلة المنخفضة. حيث أوميغا ج هو المقطع العرضي المصحح ، فإن أوميغا هي المقطع العرضي للأدبيات Z هي شحنة الحديد. الحالة M هي الوزن الجزيئي لأيون القابيل ، و MG هو الوزن الجزيئي للحديد.

غاز الخلفية ، والذي عادة ما يكون النيتروجين يسقط ثيلان من T أولي D مقابل ثيلان أوميغا سي ، يتوافق المنحنى الناتج مع المعادلة التالية. يمكن استخراج المعلمتين X و A عن طريق تركيب المؤامرة على علاقة خطية. يتوافق الميل X مع عامل النسبة الأسية ، ويمثل A ثابت الملاءمة المحدد.

احسب معامل ارتباط الملاءمة R تربيع. القيم المقبولة ل R تربيع أكبر من 0.95. قد تكون قيمة معامل الارتباط المنخفضة ناتجة عن عدم اكتمال البروتين ، وشيخوخة العينة.

الظروف التجريبية غير المتشابهة المستخدمة لبروتينات العيار المختلفة والطيف الصاخب والمعالجة غير المكتملة للبيانات أو خطأ في الحساب. قم بتصحيح وقت الانجراف باستخدام العامل الأسي المحدد X والتحقق من صحة حساباتك عن طريق إعادة تعيين أوميغا C مقابل T prime D. حدد مرة أخرى ، معامل الارتباط. من المتوقع أن تكون القيم الأعلى من 0.95 مماثلة للخطوات الموضحة من قبل ، وتصحيح وقت الانجراف المقاس للبروتين أو مركب البروتين المستهدف ومعايرة وقت الانجراف للبروتين المستهدف أو مركب البروتين باستخدام العامل الأسي المحسوب X.احسب أوميغا للبروتين المستهدف أو مركب البروتين باستخدام الثابت المحدد A حيث أوميغا يساوي TD. كرر هذه الخطوات لكل حالة تجريبية.

عند تحديد مساحة المقطع العرضي لمركب البروتين أو البروتين غير المعروف ، نوصي بتكرار كل تجربة ثلاث مرات على الأقل وتحديد الانحراف المعياري لهذه القياسات الثلاثية بمجرد تحديد قيم المقطع العرضي للتصادم. يتم استخدام مناهج النمذجة من أجل التنبؤ بالهيكلية أو ترتيبات المجمع. يتم ذلك عن طريق تركيب قيم المقطع العرضي للتصادم التجريبي ضمن قيم أوميغا السيليكو المحسوبة من هياكل النموذج المتولدة بشكل عام ، ولا يزال هذا المجال في سنواته الأولى وهناك حاجة إلى مزيد من التطوير لجعل هذا النهج عاما وقابلا للتطبيق على مجموعة واسعة من المجمعات.

هنا تمثيل سطحي للشكل الرباعي للهيموجلوبين البقري. يمكن أن يكون مركب الهيموجلوبين الناقل للأكسجين مثالا على النهج المذكور أعلاه. الهيموجلوبين هو مركب بروتين رباعي يتكون من وحدتين فرعيتين من ألفا ووحدتين فرعيتين من بيتا ، ملونة باللونين الأزرق والأحمر على التوالي ، والتي تشكل ثنائيا من ثنائيات ألفا بيتا.

طيف IMMS للهيموجلوبين هنا. يكشف طيف IM ms المكتسب للمركب عن توزيع سلسلة شحنة رئيسية يتوافق مع سلسلة الشحنة المعقدة والثانوية السليمة ، والتي تناسب كتل ثنائي ألفا بيتا والوحدات الفرعية أحادية ألفا وبيتا. يظهر هنا احتجاز الكربون وتخزينه النظري والمقاسب لأشكال مختلفة من الهيموجلوبين.

استخدام قيم وقت الانجراف المسترجعة للعديد من حالات الشحنة لأشكال dimeric و tetrameric لحساب قيم أوميغا. تمت مقارنة هذه بالقيم النظرية. بالنظر إلى أن المركب الرباعي له ثلاثة احتمالات للارتباط إما ثنائي السطوح دوري أو سلسلة تشبه العبوات.

من خلال حساب الزيادة في أوميغا عند الانتقال من ثنائي إلى رباعي ، يمكن التنبؤ بالتنظيم الهيكلي. أظهرت الدراسات السابقة وتجاربنا الخاصة ارتباطا قويا بين ccss المقاسة ومساحات سطح البروتين المشتقة من البيانات الهيكلية البلورية يمكن استخدام هذا الارتباط لحساب الزيادة المتوقعة في مساحة سطح رباعي الأبعاد مقارنة بثنائي لأشكال التعبئة المختلفة.

يتم ذلك من خلال النظر في كل جسم شبه كروي لوحدة فرعية. ستزيد سلسلة مثل التجميع من CCS الرباعي بحوالي مرتين بينما ستؤدي التعبئة C four أو D two إلى زيادة بحوالي 1.5 و 1.67 على التوالي. كانت النسبة المحسوبة بين قيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه المقاسة للشكلين الرباعي والدقني للهيموجلوبين 1.57 زائد أو ناقص 0.03.

هذا الرقم أن الهيكل الأصلي ليس منظما خطيا ، ولكنه مرتب في شكل أكثر إحكاما ، إما كرباعي دوري أو ثنائي السطوح. عند تكرار نفس الحساب على التركيب البلوري الذي تم حله للهيموجلوبين ، كانت نسبة المساحات السطحية لأشكال رباعي الرطوبة إلى DME 1.63 ، وهو ما يناسب تناظر D اثنين. من الواضح أن هذا النموذج الهندسي قد تم تبسيطه وأن الوحدات الفرعية للبروتين ليست كروية فقط.

ومع ذلك ، يوضح هذا الحساب الإمكانات المثيرة التي يحملها IMMS للكشف عن تعبئة المجمعات ذات الهياكل عالية الدقة غير المعروفة. لقد أوضحت لك للتو كيفية قياس وقت الانجراف لمجمعات البروتين والبروتين التي تستلزم كيفية حساب قيم المقطع العرضي للتصادم. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم الحصول على بيانات IMMS لبروتينات العيار باستخدام نفس الظروف المستخدمة بالضبط لمجمعات البروتين أو البروتين المستهدفة.

علاوة على ذلك ، نوصي بشدة بتكرار ثلاث مرات على الأقل من هذه التجارب وتحديد الانحراف المعياري لهذه القياسات الثلاثية. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.