التعبير ، Solubilization منظفات ، وتنقية من الناقل الأغشية ، ومقاومة الأدوية المتعددة MexB البروتين

من أجل تنقية بروتين غشاء Mex B ، يتم التعبير عن Mex B لأول مرة في الإشريكية القولونية باستخدام طرق الحمض النووي المؤتلف. ثم يتم عزل الأغشية ويتم إذابة بروتينات الغشاء بمنظف معتدل. يتم تنقية بروتين الغشاء المذاب من خلال iMac ويتم تنقية البروتين بشكل أكبر من خلال كروماتوغرافيا ترشيح الجل.

يتم تحديد مستوى تنقية البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS. على الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لناقلات الغشاء المقاومة للأدوية المتعددة ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقه على بروتينات الغشاء الأخرى التي توضح أن الإجراءات اليوم سيتم تشكيلها بواسطة طالب دراسات عليا من مختبري لهذا الإجراء ، سيتم استنساخ Mex B من pseudomonas Aosa في متجه التعبير PET 30 B plus بحيث يتم التعبير عن Mex B بعلامة الهيستامين HEXA الطرفية C. ابدأ في المساء بتلقيح أربعة ثلاثة أرطال من مزارع المايسين بمحولات جديدة أو استخدم مخزونا مجمدا ، وقم بزراعة الثقافات على أسطوانة عند 37 درجة مئوية طوال الليل في الصباح.

استخدم الثقافات الليلية لتلقيح 150 مل من LB تحتوي على 30 ميكروغرام لكل ملليلتر. هل يمكن أن ينمو Mycin الثقافة عند 37 درجة مئوية على شاكر في فترة ما بعد الظهر؟ استخدم المزرعة الصغيرة لتلقيح ستة أضعاف لتر واحد ، ووسطين XYT يحتويان على 30 ميكروغرام لكل مليلتر.

هل يمكن للميسين في قوارير السرخس الخلفية؟ استخدم 25 مل لكل مزرعة لتخفيف من واحد إلى 40. قم بزراعة الثقافات عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى كثافة بصرية.

600 من 0.4 إلى 0.6 ، حوالي 1.5 ساعة. عندما تصل الثقافات إلى الكثافة المناسبة ، قم بتحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة 0.5 مل من ضرس واحد. IPTG. ضع جميع القوارير مرة أخرى في الخلاط واستمر في زراعتها عند 30 درجة مئوية طوال الليل حتى حصاد البكتيريا في صباح اليوم التالي.

استرجع الثقافات من شاكر وقم بتبريدها. ثم لحصاد الخلايا ، قم بنقل المزارع إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة بمعدل 5000 دورة في الدقيقة في جهاز طرد مركزي واسع النطاق أثناء قيام الخلايا بالطرد المركزي. تكملة 100 مل من المخزن المؤقت لإعادة تعليق الخلية مع الحمض النووي ومثبطات البروتياز والليزوزيم.

استكمل أيضا حصتين من علة تعليق Resus الغشائية بمثبطات الإنزيم البروتيني كما هو موضح في هذا الجدول. احتفظ بجميع المحاليل الثلاثة على الجليد عند اكتمال الطرد المركزي. تنفق Resus الكريات الخلية في 100 ملليلتر من الخلية معلقة resus Buffer.

بعد ذلك ، استخرج الخلايا. يتم تحميل تعليق الخلية في خلية الضغط الفرنسية ويتم وضع الخلية على المكبس الفرنسي. يتم الضغط حتى يصل إلى 12،000 رطل لكل بوصة مربعة.

يتم فتح الصمام بكمية صغيرة جدا بحيث تتسرب الخلايا المكسورة. من المهم عدم فتح الصمام كثيرا وترك الخلايا تتدفق لأنها ستنطلق بضغط ضئيل جدا ولن يتم كسرها بكفاءة. اجمع محللة الخلية في زجاجة ، وتبقى باردة على الجليد.

مرر محلول الخلية عبر خلية ضغط فرنسية مرة أخرى بمعدل 12،000 رطل لكل بوصة مربعة. انقل محللة الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي SS 34 وأجهزة الطرد المركزي لإزالة بقايا الخلية عند 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في دوار SS 34. التحليل الموضح هو التالي.

تستخدم لتحضير جزء الغشاء. انقل بعناية supinate إلى ti. 6 4 ، 7 0.5 أنابيب طرد مركزي فائقة ، أجهزة طرد مركزي في دوار TI 6 4 7 0.5 عند 40 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 50 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

تجاهل الاستلقاء. استخدم ماصة لإعادة تعليق الحبيبات برفق ، والتي تحتوي على أغشية الخلايا في حوالي 25 مل من الغشاء ، ونقل المخزن المؤقت لتعليق Resus تعليق الغشاء إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وكسب أجهزة الطرد المركزي في دوار TI I 6 4 7 0.5 من 40،000 دورة في الدقيقة لمدة 50 دقيقة من أربع درجات مئوية وإعادة تعليق لوحة الغشاء المغسولة في 25 مل من عازلة تعليق الغشاء Resus. بعد ذلك ، قم بإذابة بروتينات الغشاء في الأغشية المعلقة عند حوالي 25 ملليلترا.

أضف ستة ملليلتر من 10٪ DDM بحيث يكون تركيز المنظف النهائي 2٪ DDM ، هز الخليط عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين بعد حضانة ساعتين في وجود جهاز طرد مركزي DDM ، الخليط عند 40،000 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الدوار TI I 6 4 7 0.5. من أجل فصل مجمعات منظفات البروتين القابلة للذوبان عن البروتينات غير القابلة للذوبان. احتفظ ب natant الذي يحتوي على مجمعات منظفات بروتين Mex B لاستخدامها في التنقية ، وقم بخلط المذنب المستلق الذي يحتوي على مجمعات منظفات بروتين Mex B مع ملليلترين من حبات التقارب المعدنية المتوازنة في Resus معلق Buffer لمدة ساعة واحدة على أسطوانة عند أربع درجات مئوية بعد ربط البروتينات بالراتنج.

صب الملاط في جسم عمود تدفق الجاذبية وتخلص من التدفق من خلاله. اغسل العمود ب 20 مل أو 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت لربط iMac والغسيل عند اكتمال غسل العمود. قم بإزالة البروتينات المرتبطة ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لشطف iMac.

خذ 10 عينات ميكرولتر من كل جزء من الشطف. تخلط مع 10 ميكرولتر من عينة SDS مرتين ، وقم بتحليلها على 10٪ بولي أكريلاميد. جل SDS.

تقدير كمية ونقاء mex B في كل كسر. اسحب الأجزاء التي تحتوي على مجمعات منظفات بروتين Mex B وركزها في مكثف دوران عند أربع درجات مئوية. كن حذرا من أن البروتين لا يترسب في هذه الخطوة.

استخدم عدة دورات قصيرة وراقب هطول الأمطار. بعد كل دورة ، انتقل إلى تنقية الكسور المجمعة باستخدام عمود ترشيح الجل. قم بتوازن الوردة الفائقة 12 HL 30 على 10 عمود مع 24 مل من المخزن المؤقت للتشغيل وانتظر خط أساس مسطح.

بعد ذلك ، اشطف حلقة تحميل نظام الممثل باستخدام المخزن المؤقت للتشغيل. قبل تطبيق البروتين على العمود ، قم بتصفية محلول البروتين باستخدام مرشح حقنة. ثم قم بتحميل ما يصل إلى 240 ميكرولترا من محلول البروتين على العمود ببروتين يصل إلى خمسة ملليغرام لكل ملليلتر.

قم بتشغيل 1.5 وحدة تخزين عمود من المخزن المؤقت واجمع 0.25 ملليلتر من الكسور. تتخلص مجمعات منظفات البروتين XB كذروة عند حوالي 10 إلى 15 مل من حجم الشطف. خذ خمس عينات ميكرولتر من كسور الذروة.

امزج كل عينة واحدة إلى واحدة مع المخزن المؤقت لعينة SDS مرتين. قم بتحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ لتقدير كمية ونقاء ME Mex B في كل جزء ، واسحب الكسور التي تحتوي على ME B النقي ، وقد تم تحميل هلام بولي أكريلاميد هذا بكسور مسحوبة من عمود iMac وكسور فردية من عمود ترشيح الجل. بعد عمود ترشيح الجل ، يظهر البروتين نقيا على جل بولي أكريلاميد الملون بالكوماسي.

أثر من عمود ترشيح الجل الذروة الرئيسية لمركب منظف البروتين المتدفق من العمود. يبلغ متوسط إنتاجية بروتين mxb حوالي ملليغرامين لكل ستة لترات من مزراعتين XYT بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذا الإجراء في ثماني ساعات إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن بروتين الغشاء القابل للذوبان والتنقية.