تقييم تكرار الطفرات في البكتيريا باستخدام مقايسة بيتا جلوكوزيداز

خذ ثقافة من البكتيريا المعدلة وراثيا.

يتم تحفيز البكتيريا للتعبير عن متغير متحور من بوليميراز الحمض النووي مع نشاط تدقيق معيب ، مما يزيد من فرص حدوث خطأ في النسخ المتماثل.

يمكن أن تؤدي هذه الأخطاء إلى طفرات تلقائية في المنطقة التنظيمية ، مما يؤدي إلى قمع جين بيتا جلوكوزيداز ويؤدي إلى التعبير عن إنزيم بيتا جلوكوزيديز.

اجمع العينات على فترات زمنية منتظمة وقم بتقييم عدد الأجيال البكتيرية في كل مزرعة. قم بالطرد المركزي للعينات وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت.

أضف محلول نفاذية واخلطه لتخلاذ الغشاء البكتيري.

انقل العينات البكتيرية المنفذة إلى صفيحة متعددة الآبار.

أضف ركيزة تدخل البكتيريا وتتفاعل مع إنزيم بيتا جلوكوزيداز ، مما ينتج عنه منتج ملون.

قم بقياس شدة اللون لتحديد نشاط بيتا جلوكوزيديز.

تحليل نشاط بيتا جلوكوزيداز في الثقافات البكتيرية لتحديد تواتر الطفرات عبر الأجيال.

انقل مستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية TOP10 تحتوي على ناقلات pBAD-ε و pGOOD1-εD12A11 إلى مليلتر واحد من وسائط LB المعالجة بالمضادات الحيوية.

احتضن المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف ما قبل الاستزراع من 1 إلى 250 في ثلاث قوارير تحتوي على 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة. أضف المحرضات مليمولار لكل من الأرابينوز أو IPTG أو الأرابينوز و IPTG ، واحتضان المزرعة المستحثة عند