Name: أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: تعلم تقنيات التسجيل بالتثبيت الكهربي قبل المشبكي من كاليكس هيلد في الفئران. يوضح هذا البروتوكول إعداد نسيج الدماغ بدقة للحفاظ على حيويته أثناء التجارب الفسيولوجية العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

التصحيح المشبك الإعداد : البصريات : البصريات ومهمة جدا للعثور على خلية جيدة ، وإنشاء موقف منه. في محاولة للحصول على صورة واضحة من الخلايا : حواف حادة ، لينة يبحث الخلية. مسح الحقل بالكامل للبحث عن الخلايا الرئيسية MNTB جيدة مع الكأس المرفقة. تدوير الطبق للبحث عن الكؤوس من زوايا مختلفة. في البداية ، وأنه موافق على محطة لممارسة شكل بالون. اختيار الخلية على سطح شريحة ، أو في الطبقة الثانية والخلية 2. الهدف الأول 1 / 3 الثالث من الزنازين مع ماصة تحديد Calyxes : لغشاء مزدوجة (انظر الشكل 1) انظر ، وتناوب على طبق شريحة لرؤيتها من زوايا مختلفة للمساعدة على تأكيد أنها الكأس. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="الشكل 1" width="298" height="159" /> الشكل 1 عمق كاليكس : كاليكس ينبغي أن يكون على السطح أو على مقربة من سطح ممكن. السطحية المتاحة من أجل التصحيح : استخدام مقبض غرامة التركيز على المجهر لتحديد كيفية &quot;واسعة / العميق&quot; من الكأس هو. على سبيل المثال ، سوف ~ 10 ٪ من كامل بدوره على التركيز غرامة تعطيك أكثر من مساحة كافية لرأب الصدع على. الختم على خلية قبل المشبكي : للوصول إلى خلية المرفقة ، والبحث عن تشوه &quot;صغير&quot; على سطح الخلايا نتيجة للضغط على نقاط البيع (~ 0.15psi) في ماصة ، واستخدام مناور ماصة لتشغيل أعلى والأسفل وعبر ، وحتى في سطح محطة presyn للحصول على تشوه جيدة ، ثم حرر الضغط والشفط تطبيق ، إذا لزم الأمر. PULSE ، وبيانات حيازة برنامج : الحاجة إلى زيادة حجم المخزن المؤقت قبل الاستخدام لأول مرة ، وكلما لزمت بواسطة القدرة أخذ العينات. تحتاج إلى تحميل وحدات الماكرو تعديل في كل مرة. تقاطع السائلة المحتملة : الحل هو تسجيل Presyn - 11mV (11mV سلبية). Presyn : Cslow = ~ 15 PF روبية للشركات presyn : 10 μsec ، 65 ٪ (أكثر التعويض قد أمكن ث / خارج التذبذبات) قبل تسجيل السعة : اختبار الاسترخاء الحالية (10 فولت و 10 مللي ثانية القفزة) لمعرفة ما إذا كان هو الاسترخاء monoexponential ، أي ما إذا كان يمكن أن تكون على غرار مصطلح presyn حجرة واحدة. مرشحات : تعيين في 30 كيلوهرتز و 10 كيلوهرتز (بسل تصفية 1 و 2 على التوالي) خلال قياس الاسترخاء ، للتأكد من عدم ضياع سريع مكون من جرا. خلال التسجيلات صغيرة ، وتستخدم شين شنغ 10 كيلوهرتز و5kHz. طلب مني أن LGW فقط استخدام تصفية مجموعة 1 في 30 كيلوهرتز للتأكد من أننا يمكن قياس الارتفاع مرة وصغيرة. تسمية الملفات : 7 أرقام 000mmxx ، حيث mm هو الشهر (أو الشهر والسنة) وxx هو عدد الخلايا. تنظيف خطوط الحل : تتبع خطوط تنظيفها في نهاية التجربة مع 20 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 M بواسطة ddH2O 200 مل. يتم تدوير الحلول الخارجية ، وسرعة المضخة 20-30 دورة في الدقيقة. (حل عودته من غرفة حمام تدفقات العودة إلى الاسطوانة). إنشاء 3 خطوط المنتهية ولايته لضمان امتصاص كافية. ماصة الحل تسجيل قبل المشبكي : ~ 310 ملي Osmolar Presyn الحل يجب أن يكون 310 ~ mOsm لمنع وصول R - الزيادة خلال التجربة. Presyn ماصة حل يختلف postsyn ماصة الحل (ATP &amp; Presyn وقد GTP لالسابقين). TTX الشاي محلول (كاليفورنيا لعزل التيارات) : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاولة تطبيق بعد الختم ، أو حتى ترميم ، على الخلية ، والشاي في كتل حل K - القنوات وdepolarizes الخلية. هذا ليس جيدا بالنسبة للخلية. للسبب نفسه ، فإنه قد لا يكون من الممكن إعادة استخدام شريحة بعد تطبيق TTX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن الاستجابة الأولى والأخيرة للخلية ، أو شريحة للتحقق من أي تأثير الاستقطاب لفترات طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم TTX في 1 ميكرومتر بدلا من 0.5 ميكرومتر حتى تأثير أسرع. في حاجة إلى الانتظار وقتا أقل بعد تغيير الحلول. </li></ul> قطع شرائح ضبط Vibratome : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70Hz الاهتزازات الوحشي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السعة : 1.0 ملم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سرعة إلى الأمام 0،01-0،02 مم / ثانية ، بينما قطع شرائح مع الكأس ، 0.1 سمك خلاف ذلك : 180 ميكرون (~ 150ميكرومتر في الحيوانات الاكبر سنا) </li></ul> شرائح احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (ويشمل وقت القطع) ، أي ترك في الحمام بعد قطع 15-20 دقيقة. ماصات : Presyn : 3،5-4،5 MΩ في البداية ، 3،0-3،5 MΩ عندما تشعر بمزيد من الثقة دليل استخدام مجتذب لضبط الإعدادات. استخدام ميزة تأخير بسبب الزجاج السميك (التأخير من 200 أو 1 العمل) نوع الزجاج : البورسليكات ، ومعيار الجدار ، أي خيوط القطر الخارجي : 2.0 ملم القطر الداخلي 1.16 مم مدة العرض : 7.5 سم

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

نحن لشرح التقنيات الأساسية لتسجيل التصحيح قبل المشبكي المشبك في الكأس لهيلد ، الثدييات النظام العصبي المركزي العصب الطرفي. التسجيلات الكهربائية من المحطة قبل المشبكي يسمح للقياس إمكانات العمل ، والتيارات قناة الكالسيوم ، والانصهار الحويصلة (إيماس) واللاحقة امتصاص غشاء (الإلتقام). اندماج الحويصلات التي تحتوي على ناقل عصبي يسبب غشاء الحويصلة تضاف إلى غشاء الخلية من الكأس. وتقاس هذه الزيادة في كمية من غشاء الخلية وزيادة في السعة. تخفيض لاحق في السعة يشير الإلتقام ، وعملية امتصاص أو إزالة غشاء من غشاء الكأس. الإلتقام ، أمر ضروري للحفاظ على هيكل الكأس وإنما هو أيضا ضروري لتكوين الحويصلات التي ستكون مليئة العصبي للأحداث إيماس المستقبل. وقد التسجيلات السعة في الكأس لالمعقودة من الممكن قياس مباشرة وبسرعة الافراج الحويصلي والإلتقام لاحقة في محطة الثدييات العصبية الجهاز العصبي المركزي. بالإضافة ، يمكن قياس النشاط بعد المشبكي المقابلة في وقت واحد باستخدام التسجيلات المقترنة. وبالتالي تكوين صورة كاملة عن النشاط الكهربائي قبل المشبكي وبعد المشبكي في المشبك الجهاز العصبي المركزي يمكن تحقيقه باستخدام هذا الإعداد. هنا ، تعرض طرق تحضير شريحة ، معالم شكلية لتحديد من الكؤوس المعقودة ، وتقنيات التصحيح الأساسية لقط ، وأمثلة من التسجيلات لقياس السعة وإيماس الإلتقام.

نستعرض التقنيات الأساسية لتسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp) قبل التشابكي في "كاليکس هيلد" (calyx of Held)، وهو طرف عصبي في الجهاز العصبي المركزي للثدييات. ...

مرحباً، اسمي كين باراديسو. أعمل مع لينج جانج وو في البرنامج الداخلي للمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، الواقع في مجمع معاهد الصحة الوطنية (NIH) في بيثيسدا. سأقوم بعرض تقنيات تسجيل ما قبل التشابك العصبي في الخلايا الكأسية باستخدام تثبيت الرقعة (Patch clamping).لتحضير أنسجة الدماغ، نقوم باستئصال الدماغ من الجرذ. نضع الدماغ داخل هذا المحلول، وهو محلول منخفض الكالسيوم ومبرد بالثلج، ويتم تمرير الكاربوجين فيه لضمان وصول إمدادات الأكسجين إلى الدماغ في جميع الأوقات. كما يجب أن يكون المحلول مبرداً بالثلج لتقليل قدر التلف.وبذلك يكون الدماغ الآن في هذا المحلول. نقوم بإخراجه، ثم قطعه بشكل مناسب بحيث يمكن وضعه على القاعدة، ويُثبت على القاعدة باستخدام Sano correlate أو الغراء السريع، ثم نملأ الحجرة بمحلول منخفض الكالسيوم شديد البرودة، ونقوم بتهويته، ثم نضعه على جهاز الاهتزاز، وبعد ذلك نقطع شرائح بسماكة 180 إلى 190 ميكرون، وبتردد شفرة يبلغ 70 هرتز، وسرعة تقدم للأمام تتراوح بين 0.01 إلى 0.02 مليمتر في الثانية. وهذا يعادل 10 إلى 20 ميكرون في الثانية.بمجرد الانتهاء من عمل كل شريحة، نقوم بنقل الشرائح من المحلول الملحي المبرد بالثلج إلى هذه الحجرة، التي تحتوي على محلول كالسيوم طبيعي. هذا هو نفس المحلول الذي نستخدمه أثناء التسجيل، وهو عند درجة حرارة فسيولوجية تبلغ 37 °C. بعد ذلك، نضع ال

methods-for-patch-clamp-capacitance-recordings-from-the-calyx

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويهدف هذا كمقدمة لتصحيح تسجيل المشبك من البويضات القيطم المورق. وهو يغطي إزالة الغشاء المحي ، وتشكيل ختم gigaohm (gigaseal) ، وتحويل اختياري من التصحيح إلى طوبولوجيا خارج التدريجي.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات...

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك من الكالسيوم النسخة المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات المحيطية في الدم وحيدات النوى الخلية المستمدة اللمفاويات التائية البشرية.

خلية كاملة تسجيل النسخة الكالسيوم المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات في الخلايا اللمفية تي الإنسان

نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية التي هي مناسبة للالكهربية وCA2 التصوير +. هذا الأسلوب يسمح احد لدراسة الشريط من نوع المشابك في شبكية العين باستخدام رقائق مباشرة التصحيح ، المشبك تسجيلات احد المحطات العصبية قبل المشبكي.

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

يصف هذا البروتوكول تقنية تسمى الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية الكاملة ، وهي طريقة لدراسة الخواص الكهربائية للخلايا العصبية Mauthner والخلايا الشبكية الشوكية الأخرى في أجنة الزرد.

الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلية الكاملة: طريقة لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية

طورنا في الدماغ الشوكي الحبل إعداد سليمة لتسجيل ورصد النشاط الكهربائي عبر التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية والخلايا ماوتنر الشبكي الأخرى في الأجنة الزرد. وبالتالي، نحن قادرون على تسجيل التيارات متشابك مثير والمثبطة، والنشاط قناة الجهد بوابات وإمكانات العمل من الخلايا العصبية الرئيسية في الجنين النامية.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا الجنينية الزرد ماوتنر

الموصوفة هنا هي إجراءات الحصول على فترات طويلة من التسجيل الحالي من قناة واحدة أيون مع تقنية التصحيح، المشبك الخلية المرفقة. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة، في الوقت الحقيقي، ونمط التشكل قناة مفتوحة قريبة من التي تكمن وراء إشارة البيولوجية. هذه البيانات إعلام حول خصائص القناة في الأغشية البيولوجية دون عائق.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

بعد إفراز الخلايا ، يتم استرداد غشاء البلازما المنصهر من خلال عملية تعرف باسم الالتقام الخلوي. تعمل هذه الآلية على إصلاح الحويصلات المشبكية الجديدة للجولة التالية من الإصدار. يتم التقاط الأحداث الداخلية الفردية وتحليلها من خلال استخدام تسجيلات السعة المرتبطة بالخلية في خلايا كرومافين الغدة الكظرية في الفأر.

طرق الخلية المرفقة قياسات السعة في ماوس الكظرية أليف الكروم خلية

يصف البروتوكول الحالي طريقة فعالة للاكتساب الديناميكي في الوقت الفعلي لتيارات قناة البوتاسيوم ذات الجهد الكهربائي (Kv) في خلايا عضلة القلب H9c2 باستخدام تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة.

تسجيل تيار البوتاسيوم المعتمد على الجهد على خلايا عضلة القلب H9c2 عبر تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة

هذا هو دليل على تعديل شكل micropipettes الزجاج. على وجه التحديد ، وذلك باستخدام الحرارة والضغط الجوي وتوسيع تفتق دون زيادة افتتاح الطرف ، مما يؤدي إلى انخفاض المقاومة ماصة. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على تسجيلات ضوضاء منخفضة من خلايا صغيرة لكنها مفيدة في العديد من التطبيقات.

الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

تعلم تقنيات التسجيل بالتثبيت الكهربي قبل المشبكي من كاليكس هيلد في الفئران. يوضح هذا البروتوكول إعداد نسيج الدماغ بدقة للحفاظ على حيويته أثناء التجارب الفسيولوجية العصبية.

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

استكشف المزيد من الفيديوهات