أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

مرحبا ، اسمي كين باراديسو. أعمل لدى Ling Gang Wu في المعهد الوطني للاضطرابات العصبية وبرنامج السكتة الدماغية ، والذي يقع في المعاهد الوطنية للصحة في حرم بيثيسدا. سأريكم تقنيات الكأس التي عقدت تسجيل ما قبل المشبك لقط التصحيح.

لذلك لتحضير أنسجة المخ ، نزيل الدماغ من الفئران. نضع الدماغ داخل هذا المحلول ، والذي سيكون محلول بارد ومنخفض الكالسيوم ، وسيكون فقاعات بالكربوجين للتأكد من وجود إمداد بالأكسجين للدماغ في جميع الأوقات. ويجب أيضا أن يكون الجو باردا لتقليل DA لتقليل مقدار الضرر.

لذا سيكون الدماغ الآن في هذا الحل. كنا نخرجها ونقطعها بشكل مناسب بحيث يمكن وضعها على الكتلة ، وتثبيتها على الكتلة باستخدام ارتباط سانو أو غراء مجنون ، ولكن نملأ الغرفة بعد ذلك بمحلول مثلج بارد ومنخفض الكالسيوم ، ونضعها على الهزاز ثم نقطع شرائح بسمك 180 إلى 190 ميكرون بتردد شفرة تردد 70 هرتز وسرعة متقدمة أمامية من 0.01 إلى 0.02 ملم لكل ثان. لذلك سيكون هذا من 10 إلى 20 ميكرون في الثانية.

بمجرد صنع كل شريحة ، ننقل الشرائح من محلول ملحي مثلج إلى هذه الغرفة التي تحتوي على محلول الكالسيوم العادي. هذا هو نفس الحل الذي نسجله وهو عند درجة حرارة فسيولوجية تبلغ 37 درجة. ثم نضع الشرائح هنا للتعافي.

يبقى هنا لمدة نصف ساعة إلى ساعة قبل إجراء تجارب علم وظائف الأعضاء. إذن هنا لدي الدماغ وسأخرجه من المحلول. إذن هذا دماغ أكبر لأغراض العرض التوضيحي.

هذا من فأر P 20. سنقوم بتسليمها. إنه جذع الدماغ الذي نهتم به.

لذا فإن هذه المنطقة هنا والكأس موجودة في تلك المنطقة هناك. لذا ما سنفعله هو قطع باقي الدماغ، وعزل جذع الدماغ، ثم تحضير جذع الدماغ لغرفة التقطيع. حسنا ، سنقوم بتقطيع بقية الدماغ فقط بعزل جذع الدماغ.

سأقوم بتسليمها لتوضيح مكاننا. عادة لن نفعل ذلك بهذه الطريقة ، ومرة أخرى ، يمكننا التخلص من هذا الجزء بأكمله. بإعادة تشغيله مرة أخرى ، قمنا بعزل جذع الدماغ ونقوم فقط بقطع آخر هناك.

حسنا ، هذا كل شيء. هذا هو جذع الدماغ. كأس عقد موجود هناك وهناك.

هذا هو جذع الدماغ. مرة أخرى ، سندفعها إلى الوراء قليلا. سنقوم بقطع جانب واحد من المخيخ وهذا سيسمح لجذع الدماغ بالجلوس جانبا هكذا.

نضع القليل من غراء الأكريليك سانو ونحافظ عليه جانبا ونملأه بسرعة بالثلج البارد ومحلول الكالسيوم البارد منخفض الكالسيوم. احصل على خط الأكسجين هناك في أسرع وقت ممكن. نلتقطها الآن ونحضرها إلى الاهتزاز.

ندخلها بسرعة للوصول إلى بداية الدماغ، ثم بمجرد أن نصل إلى بداية الدماغ، نخفض السرعة إلى 0.01 ملليمتر لكل ثانية. إذن إنها 10 ميكروس لكل ثانية. لذا فهي تتحرك بمعدل بطيء بشكل لا يصدق.

الجزء الأول من الدماغ هو الجزء الذي يحتوي على mtb ، وهو النيل الإنسي للجسم شبه المنحرف. وهذا هو الجزء الذي يحتوي على ، حسنا ، لذلك بمجرد أن أحصل عليها في ماصة النقل ، أحاول تقريبها من طرف الماصة قدر الإمكان. وهناك شريحة من الدماغ وأنا أنقلها بسرعة إلى هذه الغرفة ، والتي تحتوي على محلول تسجيل قياسي وهو مستويات طبيعية من الكالسيوم وأيضا درجة حرارة أعلى.

وسيسمح ذلك للشرائح بالتعافي بعد إجراءات التقطيع التي تكون جاهزة من تجارب علم وظائف الأعضاء. حسنا ، من الآن فصاعدا ، سيكون الأمر نفسه مرارا وتكرارا. المعدات التالية هي ما سأستخدمه للقيام بتثبيت التصحيح.

لدينا مجهر مستقيم ثابت المرحلة. المرحلة ثابتة ، كما قلت ، لذلك يتحرك المجهر تحتها من على مناور. نحن نستخدم الشعر المستعار ومناور نيومان الصغير لعقد المسرح ، مرحلة رأس مكبر الصوت ، نستخدم مضخم مشبك EPC 10 من heca.

وما كان يجب أن أذكره أيضا هو أننا نستخدم DIC مع ضوء الأشعة تحت الحمراء. لذلك لدينا كاميرا الأشعة تحت الحمراء هنا ، وبالتالي سيتم رؤية كل ما نراه على الشاشة عندما نبحث عن CAEs. يتم التحكم في مضخم مشبك التصحيح بواسطة هذا البرنامج ، والذي يسمى Pulse ، وهو أيضا من Heca ، وسيتحكم في مكبر الصوت وجميع تجارب علم وظائف الأعضاء.

ستظهر النتائج على هذه الشاشة. الكأس الذي تم الاحتفاظ به هو طرف كبير قبل المشبكي ، ولأنه كبير ، فإنه يسمح لنا بالتصحيح فعليا على المحطة. لذلك يمكننا أن نأخذ تسجيلات ما قبل المشبكي وهذا شيء فريد من نوعه ، خاصة في الجهاز العصبي المركزي.

وهذا يسمح لنا بقياس قنوات الكالسيوم التي يتم تنشيطها قبل التشابك. كما يمكننا أيضا قياس نشاط جهد الفعل إذا أردنا تحفيز العصب الذي يؤدي إلى الكأس. ما نقوم به في هذا المختبر هو قياس عملية تسمى إفراز الخلايا، وهي اندماج الحويصلات التي تحتوي على ناقل عصبي مع الغشاء.

الآن في تلك الحويصلات تندمج مع الغشاء في عملية تسمى إفراز الخلايا، يضيفون غشاء إلى الطرف المشبكي، ويمكننا قياس ذلك كتغيير في السعة. سنحصل على زيادة في السعة عند إضافة الغشاء إلى الطرف بحيث تكون التجارب التي سأعرضها اليوم هي قياسات السعة، قبل التشابك عند إزالة الغشاء. لذلك لا يمكنك الاستمرار في إضافة الغشاء ، عليك بالطبع إزالة بعضه.

تسمى هذه العملية الالتقام الخلوي أو امتصاص الغشاء. يمكننا أيضا قياس ذلك وسيتم قياس ذلك على أنه انخفاض في مستوى السعة، وسنعرض أمثلة على ذلك لاحقا. الآن ما يسمح لنا هذا بالقيام به هو مراقبة نشاط قناة الكالسيوم وأيضا مراقبة بعض البروتينات التي تشارك في إفراز القام الخلوي والالتقام الخلوي ودراستها.

يمكننا وضع أشياء مثل الببتيدات لمنع البروتينات التي تشارك في exo أو الالتقام الخلوي. يمكننا أيضا استخدام السموم التي تفعل نفس الشيء. يمكننا أيضا ضبط كميات الكالسيوم التي تدخل المحطة الطرفية، حتى نتمكن حقا من دراسة عملية إفراز الخلايا، وإطلاق الناقل العصبي، بالإضافة إلى امتصاص الغشاء الذي يتبع هذا الحدث.

هذا هو الأنبوب الذي يحتوي على حل التسجيل داخل الخلايا. نقوم بإعداده مسبقا ثم نقوم بتجميده ويمكننا استخدامه عادة لعدة أسابيع إلى شهر قبل الاضطرار إلى عمل حل جديد. مرة أخرى ، فكرنا مباشرة قبل إجراء تسجيلاتنا ، وستحصل دائما على كمية معينة من جزيئات الغبار أو أي نوع آخر من الحطام الذي سيصل إلى أنبوبك.

يمكنك القيام بأحد أمرين. يمكنك إما إخراج المحلول وتصفيته ، أو يمكنك تدويره لمدة دقيقة أو دقيقتين ثم سحب المحلول ، وترك الجزء السفلي الذي يحتوي على حطام ومواد أخرى بداخله. لذلك أفضل تدويرها وسأفعل ذلك الآن.

إذن هذا هو الأنبوب الذي يحتوي على المحلول داخل الخلايا. لقد تم إذابته. سنقوم بتدويرها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق تقريبا في جهاز طرد مركزي صغير ، ويجب أن يكون ذلك كافيا لإخراج أي جزيئات غبار كبيرة من المحلول.

لذا الآن أقوم فقط بسحب الجزء العلوي ، الحل الذي قمنا بنسجه للتو ، مع الحرص على عدم تحريكه ، ونقله إلى أنبوب نظيف ، وأقوم بسحب حوالي 90٪ منه. أحاول ألا أفعل ذلك مرة أخرى ، احصل على هذا القليل. لذلك سأتوقف عند هذا الحد.

أضعها على الجليد على الفور حتى تظل لطيفة وباردة أثناء التجربة. هذا مهم جدا. هذه هي واحدة من الماصات لدينا.

نستخدم هذا للتسجيلات داخل الخلايا. إنه زجاج سيليكا سميك الجدران ، قطره الخارجي ملليمترين ، قطر داخلي 1.16 ملم. أولا ، ما نفعله هو إعادة ملء الماصة.

لذلك نقوم بتطبيق الشفط ، ونضع الماصة في محلول التسجيل ونطبق الشفط لمحاولة ملء طرف الماصة جدا جدا ، والذي لن يملأ بأي طريقة أخرى. بمجرد القيام بذلك ، نأخذ أنبوبا شعريا ونملأ باقي القطب الكهربائي بمجرد أخذ الجزء الخلفي من الماصة. هذه تقنية فسيولوجيا قياسية ونقرها حرفيا.

أنت تخاطر بكسر نهاية الماصة ، ولكن سيكون لديك أيضا ، إذا لم تفعل ذلك ، فغالبا ما يكون لديك فقاعات هواء. حسنا ، نضعها الآن على حامل الماصة الخاص بنا ، والذي يتم توصيله بمرحلة رأسنا من مضخم مصنع التصحيح. هناك سلك كلوريد فضي هناك.

يتلامس سلك كلوريد الفضة مع المحلول داخل الخلايا ، وهذا يسمح لنا بقياس النشاط الكهربائي في الطرف قبل المشبكي. إذن ما نفعله هو أن نجد الشريحة التي تحتوي على الكثير من CAEs. نريد كثافة عالية من CAEs.

إذن ، نحن نبحث عن النواة الإنسية للجسم شبه المنحرف ، وهي MNTB ، وهنا توجد المحطة ، التي تشكل الكلاء المدعوم ، أو تطبيق الكأس ، كيف يتم العثور عليها. ولذا فإن ما نفعله هو البدء في المسح من خلال الشريحة. على سبيل المثال ، لدينا كأس عميق قليلا من السطح وليس هناك الكثير للتصحيحه ، لذلك نستمر في المسح الضوئي عبرنا.

إذن هذا هو الكأس هنا الذي نذهب إليه. ما قمت بوضعه هو علامتان على الشاشة ، حيث ستذهب الماصة. ويمكنك أن ترى أن هناك قطعة من الكأس التي سأذهب إليها بعد الماصة التي ستنزل.

سأمارس ضغطا إيجابيا بحيث يضغط على الكأس ، وبعد ذلك سأخفف الضغط الإيجابي. ثم يدفع الكأس لأعلى ضد الماصة ، وفي هذه المرحلة أقوم بتطبيق شفط لطيف للغاية وأحاول امتصاص الغشاء ودفعه أو جعل الغشاء يغلق على طرف الماصة. حسنا ، خففت الضغط الإيجابي.

والآن سأقوم بتطبيق الشفط. إذن نحن هنا مؤيدون، نحن نطبق نبضة خمسة مللي فولت، أو في الواقع نبضة أربعة مللي فولت. حسنا ، هذا كل شيء. حسنًا.

الآن نقوم بخفض إمكانات الغشاء ناقص 80 ، ونلغي ذراع الرافعة العابر السريع. الآن سنذهب إلى خلية كاملة. سأقوم بتطبيق شفط لطيف وأحاول البيع بالجملة.

تشير هذه العابرين للشحن إلى أنه ، وأن الماصة والخلية مستمرة الآن ، وأنه حصل على تسجيل بالجملة. هذه لقطة جميلة أخرى. لذلك كلما كان اللون الأحمر الفاتح هناك أثر السعة ، ويمكنك أن ترى أن هناك قفزة مفاجئة ثم انخفضت.

حسنا ، لقد عرضت عليك للتو التقنيات الأساسية للحصول على تسجيلات من طرف ما قبل المشبك المدعوم بالكأس لقد أوضحت لك كيفية إنتاج الشرائح التي تحتوي على النواة الإنسية للجسم شبه المنحرف. هذا هو المكان الذي ستجد فيه الكؤوس.

وقد أوضحت لكم تقنيات النظر في الشرائح. ستمر عبر كل شريحة ، بحثا عن الشريحة التي تحتوي على أكبر عدد من الكلاء الموجود على السطح. ستبحث بعد ذلك عن أكبر غشاء كيلي يمكنك العثور عليه وتصحيح سجل المشبك عليه.

وقد أوضحت لك أيضا تقنيات تسجيل مشبك التصحيح ، وهذه هي تقنيات تسجيل مشبك التصحيح القياسية.