تصور توزيع البروتين البكتيري في ثلاثة أبعاد باستخدام التصوير الفلوري

ابدأ بشريحة مغلقة تحتوي على خلايا بكتيرية موسومة بعلامة فلورية حمراء سيتوبلازمية وعلامة فلورية خضراء خاصة بالبروتين.

راقب الشريحة تحت مجهر الفلورة.

حدد موقعا يحتوي على خلايا بكتيرية معزولة جيدا وركز على مركز الخلية الممثلة.

قم بضبط أول قناة فلورية واحصل على صورة مكدس z عند معاملات محددة لالتقاط الشكل ثلاثي الأبعاد للخلية الممثلة وخلاياها المجاورة.

ثم انتقل إلى قناة الفلورة الثانية واحصل على صورة مكدس z أخرى لنفس الخلايا بنفس المعايير.

تلتقط توزيع البروتينات البكتيرية داخل الخلايا.

قم بقص خلايا فردية من كل مكدس z لعزلها لتحليل الخلية الواحدة.

محاذاة هذه الصور لتصوير توزيع البروتينات البكتيرية بالنسبة لشكل الخلية، مما يمكن من تحليل دقيق أثناء تفاعلات المضيف والممرض.

بعد إغلاق انزلاق الغطاء مباشرة، ضع السلايد على مرحلة المجهر، وبعد خمس دقائق من التوازن الحراري، استخدم عجلات تركيز المجهر لجعل منتصف الخلية في التركيز. في برنامج المجهر المرتبط تحت ND Acquisition، حدد مربع Z للحصول على مكدس Z ثم اضغط على زر Home لتعيين منتصف الخلية كنقطة بداية. اضبط حجم الخطوة إلى 0.1 ميكرومتر والمدى إلى أربعة ميكرومتر، وتأكد من أن جهاز Z مضبوط على مرحلة بيزو.

من الضروري وجود ضبابية كافية في كل من أعلى وأسفل الخلية بحيث تصبح الخلية شبه غير قابلة للتمييز عن الخلفية. اضبط قنوات الفلورسنت تحت نافذة لامبدا على إعدادات الجزيئات الفلورية التي يتم تصويرها، وتأكد من أن ترتيب التجربة مضبوط على لامبدا بحيث يتم الحصول على مكدس Z كامل في كل قناة لونية قبل التبديل. ثم، اضغط على تشغيل الآن لبدء عملية التقاط الصورة.

عندما يتم التقاط جميع الصور، افتح الملفات في برنامج تحليل الصور المناسب. ارسم مربعا حول خلية فردية وكرر تلك الخلية مرتين، مرة لكل قناة، مع التأكد من تحديد مربع التكديس المزدوج المفرط، ثم غير القناة إلى واحدة أو اثنتين. بمجرد توفر كلا المجموعتين، اختر الصور، المكدمات، الأدوات، ودمج الصور.