تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة
مارس 10, 2014
Photoactivated المجهر التعريب (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد يسمح الملاحظة المباشرة والكمي للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا القولونية الحية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور وتحديد نشاط البروتينات المرتبطة بالحمض النووي في الخلايا البكتيرية الحية بشكل مباشر. يتم تحقيق ذلك من خلال تصور الخلايا التي تعبر عن بروتين فلورسنت منشط بالصور مدمجا في بروتين ربط الحمض النووي ذي الأهمية. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في الحصول على فيلم للبروتينات الفردية التي يتم تنشيطها أثناء التصوير.
ثم يتم تحليل البيانات لتحديد توطين البروتين وتتبع البروتينات داخل الخلايا المفردة. يتم تحديد أحداث ربط الحمض النووي من خلال التغيير في معامل انتشار البروتينات المفردة عند ملامستها للكروموسومات. في النهاية ، يمكن أن توفر النتائج مقياسا كميا لتفاعلات الحمض النووي للبروتين على مستوى الخلية المفردة عن طريق حساب عدد البروتينات المرتبطة والمنتشرة لكل خلية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصلاح الحمض النووي ، مثل معدلات الإصلاح في الجسم الحي والتوزيع المكاني لمواقع الإصلاح. سنوضح الآن الطريقة عن طريق قياس نشاط إصلاح بوليميراز الحمض النووي واحد في خلايا القولونية الإلكترونية في الحياة أولا قم بعمل زلات غطاء بدون جزيئات فلورية خلفية في فرن عند 500 درجة مئوية لمدة ساعة. احرق مخزونا من زلات الغطاء بسماكة 1.5 ، وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة في رقائق الألومنيوم.
إنها جيدة لأسابيع قادمة. بعد ذلك ، ركز مليلتر من المرحلة الأسية المبكرة E coli في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر من السلالة. AB 1157 بولي أ PA m الكرز الطرد المركزي الخلايا في 2 ، 300 جم لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 ميكرولتر من الوسط المتبقي وقم بتدوير الخلايا في المحلول. بعد ذلك ، اصنع محلول مضان منخفض بنسبة 1.5٪ في الماء المقطر. امزج 500 ميكرولتر من الأيروس المذاب مع 500 ميكرولتر من اثنين × الحد الأدنى من الوسط عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات لتجارب تلف الحمض النووي باستخدام سلفونات ميثيل الميثان أو MMS مع اتخاذ الاحتياطات.
أضف 8.3 ميكرولتر من MMS إلى 500 ميكرولتر من الحد الأدنى من المتوسط قبل مزجها مع الأروس قبل أن يبرد الخليط. انشرها على زلة غطاء محترقة. انشرها بالتساوي ومتمركزة دون صنع فقاعات.
قم بتسطيح الوسادة بزلة غطاء محترقة ثانية. بمجرد أن يبرد ، قم بإزالة الغطاء العلوي من الوسادة وأضف ميكرولتر من معلق الخلية المركز. قم بتثبيت الخلايا عن طريق تغطية الوسادة بزلة غطاء محترق جديدة والضغط لأسفل برفق شديد.
يجب تصوير الخلايا في غضون 45 دقيقة قبل أن تجف. لتمديد هذا الوقت ، يمكن إغلاق الوسادة داخل حشية من السيليكون لتجارب تلف الحمض النووي. قبل التصوير ، احتضنها الخلايا على الوسادة لمدة 20 دقيقة.
في حاوية رطبة في درجة حرارة الغرفة ، يتميز المجهر بليزر تنشيط ضوئي 405 نانومتر وليزر إثارة 561 نانومتر. يتم الوصول إلى حساسية الجزيء الفردي من خلال إثارة أربعة الفلورو فقط داخل قسم رفيع فوق سطح انزلاق الغطاء باستخدام إضاءة مائلة للغاية ، ويتم تسجيل انبعاث التألق على كاميرا CCD تضرب الإلكترون. ضع العينة على مرحلة المجهر وقم بتركيز الخلايا.
تحت إضاءة الضوء المرسلة، حدد مجال رؤية مقصوصا لتقليل حجم البيانات وزيادة سرعة قراءة الكاميرا. قم بتغطية العينة من الضوء المحيط وقم بتشغيل كسب كاميرا CCD التي تضاعف الإلكترون لاكتشاف الفلورو الرباعي الفردي. اضبط معدل الإطارات على 15.26 مللي ثانية لكل إطار.
يتضمن ذلك قراءة الكاميرا 0.26 مللي ثانية يجب أن تكون أوقات التعرض الزمنية قصيرة بما يكفي لمراقبة البقع الفلورية الحادة مع القليل من الحركة الصاخبة. من ناحية أخرى ، يجب أخذ عينات من المسارات على فترات زمنية طويلة بما فيه الكفاية للتمييز بوضوح بين الحدود والجزيئات المنتشرة. اعرض الآن بيانات الكاميرا للتحقق من إشارة الخلفية المظلمة.
قم بتشغيل الليزر 561 نانومتر وتحقق من إشارة خلفية الإثارة. قم بتشغيل الليزر 405 نانومتر للتنشيط الضوئي لبروتينات اندماج الكرز Paul one PA M وزيادة الكثافة حتى تظهر بقع الفلورسنت من الجزيئات المفردة. الآن اضبط زاوية شعاع الإثارة لإضاءة جزء رفيع فقط من العينة.
أغلق سطح انزلاق الغطاء. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن البروتينات الفلورية المفردة وتوطينها بدقة ، وبالتالي فإن المحاذاة المثلى وحساسية المجهر ستكون حاسمة لجودة البيانات. تحقيقا لهذه الغاية ، قم بتركيز شعاع الليزر في المستوى البؤري الخلفي لهدف فتحة عددية 100 × 1.4.
تؤدي ترجمة عدسة التركيز البؤري بشكل عمودي على الحزمة إلى تحريك التركيز البؤري بعيدا عن مركز الهدف، مما يتسبب في خروج الحزمة من الهدف بزاوية. اهدف إلى زيادة شدة التألق إلى أقصى حد وتقليل الخلفية. ابحث عن مجال رؤية جديد للخلايا في وضع الفحص المجهري للضوء المرسل وركز الصورة.
التقط لقطة كاميرا لتسجيل الخطوط العريضة للخلية. قم بتشغيل الليزر 561 نانومتر وتبييض التألق الذاتي الخلوي وبقع الخلفية على الغطاء. انزلق لبضع ثوان.
قبل البدء في الحصول على البيانات ، ابدأ في الحصول على فيلم راحة اليد تحت إثارة مستمرة 561 نانومتر. قم بتشغيل الليزر 405 نانومتر وقم بزيادة شدته تدريجيا على مدار الفيلم لتصل إلى واط واحد لكل سنتيمتر مربع. تجنب شدة 405 نانومتر أعلى التي تسبب التألق الذاتي الخلوي.
انتبه إلى كثافة جزيئات الفلورسنت. من المهم الحفاظ على معدلات التنشيط منخفضة بحيث يتم عزل بقع الفلورسنت بوضوح في كل إطار. سجل حوالي 10,000 إطار لكل فيلم ، والذي يستغرق عادة ما يستغرق مجال الرؤية المقطوع ما يصل إلى ثلاث دقائق وما يصل إلى غيغابايت من مساحة القرص الصلب.
لاحظ أنه بمجرد تصوير مجال الرؤية ، يتم تبييض فلوروفورات الكرز بشكل لا رجعة فيه ولا يمكن ملاحظتها. مرة أخرى ، يستخدم الإجراء التالي برنامجا مخصصا في matlab. تظهر الفلوروفورات المفردة كوظائف انتشار نقطي أو psfs.
في الفيلم ، يتم تحديد psfs لأول مرة في صورة مفلترة بتمرير النطاق باستخدام نواة Gaussian بقطر سبعة بكسل تتوافق مواضع المرشح مع P SFS مع ذروة شدة البكسل 4.5 مرة فوق الانحراف المعياري للخلفية. يعمل البكسل الأكثر سطوعا محليا لكل مرشح PSF كتخمين أولي لتركيب دالة غاوسية بيضاوية الشكل. معلمات الملاءمة الحرة هي X الموضع y ، والموضع X العرض ، ودوران العرض Y ، والزاوية ، والسعة ، وإزاحة الخلفية.
يفسر القناع الغوسي الإهليلجي حركة الجزيء أثناء وقت التعرض ، مما يؤدي إلى طمس وتشويه مخطط PSF. يجب أن تظهر توطين XY الناتجة من جميع إطارات فيلم راحة اليد على صورة المجهر الضوئي المرسلة لنفس مجال الرؤية لتوطين Paul one PAM Cherry داخل المنطقة المركزية لخلايا القولونية الإلكترونية. يقيس التتبع الآلي حركة البروتينات ، ولكن الاختيار الناجح لنافذة التتبع أمر بالغ الأهمية.
أولا ، قم بتشغيل خوارزمية التتبع لمجموعة من معلمات نافذة التتبع. ارسم عدد المسارات المقاسة لكل خلية مقابل نافذة التعقب لتحديد أصغر نافذة تتبع ممكنة لا تقسم المسارات ، وعرض المسارات الناتجة على صورة المجهر الضوئي المرسلة لنفس مجال الرؤية. لتصور التوزيع المكاني لحركة الجزيئات داخل الخلايا ، يجب أن تعرض مسارات P واحدة الانتشار المحصور داخل خلايا مفردة إذا بدا أن جزءا من المسارات يتقاطع بين الخلايا ، وهذا يشير إلى أن الجزيئات المنفصلة تم ربطها بشكل خاطئ لأن نافذة التتبع تم اختيارها كبيرة جدا أو كان معدل تنشيط الصورة مرتفعا جدا.
رسم التوزيع التراكمي لأطوال الخطوات بين التوطين المتتالي. يرتفع المنحنى ويشبع بسلاسة لنوافذ التتبع الكبيرة بما فيه الكفاية ، ولكنه يظهر حافة قطع إذا تم اختيار النافذة صغيرة جدا. بمجرد اختيار نافذة تتبع مناسبة ، يمكن تحليل خصائص الانتشار لبول واحد.
احسب متوسط الإزاحة المربعة أو MSD بين التوطين المتتالي لكل مسار بإجمالي n خطوات فقط استخدم المسارات التي تحتوي على خمسة توطين على الأقل لتقليل عدم اليقين الإحصائي ل MSD. بعد ذلك ، احسب معامل الانتشار الظاهر لكل مسار من MSD. يصحح المصطلح الثاني خطأ الترجمة المقدر.
هذه هي قيم الفصل الدراسي الثاني. في هذا المثال ، ارسم الآن رسما بيانيا لقيم معامل الانتشار المقاسة من جميع المسارات في مجال الرؤية ل pol one في الخلايا غير التالفة وللشرطة الأولى في الخلايا الخاضعة لعلاج تلف الحمض النووي باستخدام MMS ، تحدد الأشرطة الحمراء عدد جزيئات pol one الفردية التي تبدو مرتبطة بالكروموسوم وتنتشر بأقل من 0.15 ميكرون مربع في الثانية. في حين أن الجزيئات المنتشرة بحرية تتحرك حوالي 0.9 ميكرون مربع في الثانية.
بعد ال يقيد بول واحدة جزيئات يكون عينت. يمكن تصور مواقع مواقع الربط في الخلايا غير التالفة وفي الخلايا المصابة بتلف التصلب العصبي المتعدد. يوفر جزء المسارات المرتبطة بالنسبة للعدد الإجمالي للمسارات المرصودة مقياسا كميا مباشرا لنشاط إصلاح الحمض النووي للبول.
تم إجراء تنشيط صور واحد في الجسم الحي لبروتينات اندماج الكرز pol one PA m في خلايا الإشريكية القولونية الحية. يمكن أن يقتصر تنشيط الصورة على فلوروفور واحد من الكرز PA m في خلية واحدة ، وكشفت معدلات تنشيط الصورة الأعلى عن المزيد من جزيئات الفلورسنت. تم إجراء تحليل التوطين لكل إطار من فيلم راحة اليد.
تم قياس الدقة باستخدام جزيئات غير متحركة في الخلايا الثابتة أو جزيئات مرتبطة في الخلايا الحية ، ووجد أنها 40 نانومتر متوافقة مع التنبؤ النظري. بعد ذلك، تم تعيين عتبة الترجمة عندما تكون منخفضة جدا. تم اختيار القمم العشوائية في ضوضاء الخلفية عن طريق الخطأ كمناصب مرشحة ، بينما إذا كانت العتبة مرتفعة جدا ، فقد تم تفويت بعض المواقع.
احتلت النتيجة بول واحدة توطين المنطقة مركزية من الخلية, على نطاق واسع يلخص التنظيم مكانية من ال [إ] قولونية نوكلية. يعرض أغلبية من بول واحدة يتتبع في خلايا غير تالفة انتشار. تحتوي الخلية النموذجية على عدة مئات بول واحد مسارات يتفق مع رقم النسخ من تقريبا 400 بول واحد جزيء لكل [إ] قولونية خلية.
يمكن تحديد أنواع مختلفة من الحركة الجزيئية عن طريق حساب قيم MSD على مدى مجموعة من أوقات التأخير ، وتعطي الحركة الموجهة منحنى مكافئ. تتميز الحركة البراونية بخط مستقيم. يصل منحنى الانتشار المحصور إلى هضبة ويمثل إزاحة منحنى MSD للجسيمات غير المتحركة عدم اليقين في التوطين.
ارتفع منحنى MSD الناتج لبول واحد خطيا لأوقات تأخير قصيرة يدل على الحركة البراونية ومشبع في أوقات تأخير أطول بسبب حبس الخلايا. باستخدام هذه الطرق ، تم قياس نشاط إصلاح الحمض النووي لبول ، استجابة لتلف ألكلة الحمض النووي الخارجي في الخلايا غير التالفة. يبدي الانتشار معامل رسم بياني من بول واحدة السكان مسيطرة من ينشر جزيئات.
يمكن أن تشارك الجزيئات القليلة المرتبطة في تكرار الحمض النووي وإصلاح تلف الحمض النووي الداخلي تحت ضرر مستمر يبلغ 100 مللي مولار MMS. يزداد تواتر المسارات ذات معاملات الانتشار القريبة من الصفر بشكل كبير. هذا يدعم النموذج أن كثير بول واحدة جزيئات ينبغي كنت تشارك في [دنا] إصلاح مع مطفرات حاضرة يتبع هذا إجراء.
يمكن إجراء طرق تحليل البيانات الأخرى مثل التوطين والتجميع من أجل تحديد التوزيع المكاني للبروتينات في الخلية والتحقيق في وجود مجمعات بروتينية أكبر تشارك في إصلاح الحمض النووي.
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة طريقة لتصوير وكمّية نشاط بروتين ربط الحمض النووي في خلايا الإشريكية القولونية الحية باستخدام التصوير المجهري للموقع المنشط بالضوء (PALM) جنبًا إلى جنب مع تتبع الجزيء الواحد. يتيح هذا النهج للباحثين مراقبة تفاعلات البروتين-الحمض النووي مباشرة وتحليل ديناميكياتها داخل البيئة الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- فهم تفاعلات البروتين-الحمض النووي أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول العمليات الخلوية.
- قد لا توفر الطرق التقليدية الدقة اللازمة لتحليل الجزيء الواحد.
- PALM يوفر تقنية قوية لمراقبة هذه التفاعلات في الوقت الحقيقي.
- تركز هذه الدراسة على بروتينات ربط الحمض النووي في الخلايا البكتيرية.
هدف الدراسة
- لتصوير وكمّية نشاط بروتينات ربط الحمض النووي في الخلايا الحية.
- لقياس نشاط إصلاح بوليميراز الحمض النووي واحد في الإشريكية القولونية.
- لتوفير مقياس كمّي لتفاعلات البروتين-الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة.
الطرق المستخدمة
- تم تحضير الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية المنشطة ضوئيًا.
- تم الحصول على أفلام للبروتينات الفردية أثناء التنشيط الضوئي.
- اشتمل تحليل البيانات على تتبع مواقع البروتينات ومعاملات الانتشار.
- تم تحسين تقنيات التصوير المجهري لاكتشاف الجزيء الواحد.
النتائج الرئيسية
- نجاح في تصوير تفاعلات البروتين-الحمض النووي في الإشريكية القولونية الحية.
- بيانات كميّة على عدد البروتينات المرتبطة والمنتشرة لكل خلية.
- رؤى حول التوزيع المكاني لمواقع الإصلاح.
- الطريقة الموضحة يمكنها معالجة أسئلة رئيسية في إصلاح الحمض النووي.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة نهجًا جديدًا لدراسة تفاعلات البروتين-الحمض النووي.
- تعزز فهم آليات إصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى العمليات الخلوية الأخرى التي تتضمن بروتينات ربط الحمض النووي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of protein-DNA interactions in live bacterial cells, providing a single-cell level readout of DNA-binding protein activity. By measuring the fraction of bound molecules via changes in diffusion coefficient, it offers a quantitative proxy for substrate abundance and target engagement in a native cellular context. This supports mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular behavior to functional output in DNA repair pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying target engagement of DNA-binding proteins in live cells.
- Operational Value: Provides a direct readout of protein activity through bound vs. diffusing molecule ratios, supporting functional validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring DNA repair activity in response to genotoxic stress, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, single-cell resolution data on protein-DNA binding events suitable for high-content screening formats.
- Reproducibility: Uses standardized photoactivation and tracking parameters to ensure consistent localization and diffusion measurements across experiments.
- Scalability: Compatible with microfluidic and high-throughput imaging setups for screening compound effects on DNA repair protein dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly measures DNA repair activity in live cells, aligning with biomarker strategies in genotoxicity and oncology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to in vivo functional readouts, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables quantification of target modulation under DNA damage conditions, informing preclinical safety and efficacy assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, particularly for compounds targeting DNA repair or genome maintenance pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing how DNA-binding proteins engage chromosomes under basal and stressed conditions.
- Screening: Enables assessment of compound effects on protein-DNA interaction kinetics through changes in bound molecule fractions.
- Analytics: Generates diffusion coefficient histograms and mean square displacement curves as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular binding events to functional DNA repair outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any DNA-binding protein of interest in live bacterial or adaptable eukaryotic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time visualization of target engagement in a physiological context.
- Operational Value: Standardizes single-molecule imaging and tracking workflows for reproducible quantification of protein dynamics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional DNA repair activity, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative engagement and pathway modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule microscopy, photoactivation techniques, and MATLAB-based tracking analysis.
- Needs a TIRF-capable microscope with 405 nm and 561 nm lasers, EM-CCD camera, and environmental control for live bacterial imaging.
- Demands standardization of photoactivation intensity and tracking window parameters to avoid artifacts in molecule linkage and diffusion measurements.
- Adaptation to eukaryotic systems may require optimization of nucleoid structure, photoactivation density, and background fluorescence.
- Practical limitations include photobleaching of PA-mCherry after acquisition and the need for low activation rates to ensure single-molecule resolution.
