تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو التصوير المباشر وقياس نشاط البروتينات الرابطة للحمض النووي (DNA) في الخلايا البكتيرية الحية. ويتحقق ذلك من خلال تصوير الخلايا التي تعبر عن بروتين فلوري يتم تنشيطه ضوئياً ومدمج مع بروتين رابط للحمض النووي مستهدف. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تسجيل مقطع فيديو لعملية التنشيط الضوئي للبروتينات الفردية أثناء تصويرها.

ثم يتم تحليل البيانات لتحديد مواقع البروتينات وتتبع حركتها داخل الخلايا المفردة. ويتم التعرف على أحداث ارتباط الحمض النووي DNA من خلال التغير في معامل الانتشار للبروتينات المفردة عند ملامستها للكروموسومات. وفي النهاية، يمكن أن توفر النتائج قياساً كمياً لتفاعلات البروتين مع DNA على مستوى الخلية المفردة عن طريق عدّ عدد البروتينات المرتبطة والمنتشرة لكل خلية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال إصلاح الحمض النووي DNA، مثل معدلات الإصلاح داخل الكائن الحي والتوزيع المكاني لمواقع الإصلاح. سنقوم الآن بتوضيح الطريقة عن طريق قياس نشاط الإصلاح لإنزيم DNA polymerase one في خلايا e coli الحية. أولاً، قم بتجهيز شرائح غطاء زجاجي خالية من الجسيمات الفلورية الخلفية في فرن عند 500 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة. قم بحرق كمية احتياطية من شرائح الغطاء ذات السماكة رقم 1.5، وخزنها في درجة حرارة الغرفة داخل ورق ألومنيوم.

تظل هذه العينات صالحة لعدة أسابيع قادمة. بعد ذلك، قم بتركيز ملليلتر واحد من بكتيريا E coli في طور النمو الأسي المبكر من السلالة AB 1157 poly a PA m cherry في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 2,300 G لمدة خمس دقائق.

أزل السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 20 µL من الوسط المتبقي، ثم استخدم جهاز رج الخلايا (vortex) لإذابتها في المحلول. بعد ذلك، قم بتحضير محلول aros بتركيز 1.5% منخفض الفلورة في ماء مقطر. اخلط 500 µL من الـ aeros المذاب مع 500 µL من وسط أدنى (minimal medium) بتركيز 2x، عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة عدة مرات لإجراء تجارب تلف الحمض النووي (DNA) باستخدام ميثيل ميثان سلفونات أو MMS مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة.

أضف 8.3 µL من MMS إلى 500 µL من الوسط الغذائي الأدنى قبل خلطه مع aros وقبل أن يبرد الخليط. وزعه على شريحة غطاء محروقة. قم بتوزيعه بالتساوي وفي المركز دون تكوين فقاعات.

قم بتسطيح الوسادة باستخدام شريحة غطاء محروقة ثانية. وبمجرد أن تبرد، أزل الغطاء العلوي عن الوسادة وأضف ميكرولتر واحد من معلق الخلايا المركز. قم بتثبيت الخلايا عن طريق تغطية الوسادة بشريحة غطاء محروقة جديدة والضغط لأسفل برفق شديد.

يجب تصوير الخلايا في غضون 45 دقيقة قبل أن تجف. ولتمديد هذه الفترة، يمكن ختم الوسادة داخل حشية سيليكون في تجارب تلف DNA. قبل تصوير الخلايا، قم بتحضينها على الوسادة لمدة 20 دقيقة.

في حاوية مرطبة عند درجة حرارة الغرفة، يتميز المجهر بوجود ليزر تنشيط ضوئي بطول موجي 405 nanometer وليزر استثارة بطول موجي 561 nanometer. يتم تحقيق حساسية الجزيء المنفرد عن طريق استثارة الفلوروفورات فقط ضمن مقطع رقيق فوق سطح شريحة التغطية باستخدام إضاءة عالية الميل، ويتم تسجيل انبعاث الفلورة بواسطة كاميرا CCD مضاعفة للإلكترونات. ضع العينة على منصة المجهر وقم بضبط تركيز الخلايا.

تحت إضاءة الضوء النافذ، حدد مجال رؤية مقصوص لتقليل حجم البيانات وزيادة سرعة قراءة الكاميرا. قم بتغطية العينة لمنع الضوء المحيط وتشغيل كسب كاميرا CCD ذات المضاعف الإلكتروني للكشف عن الفلور الواحد. اضبط معدل الإطارات على 15.26 milliseconds للإطار الواحد.

يشمل ذلك زمن قراءة الكاميرا البالغ 0.26 millisecond. يجب أن تكون أزمنة التعريض قصيرة بما يكفي لرصد بقع فلورية حادة مع الحد الأدنى من ضبابية الحركة. ومن ناحية أخرى، يجب أخذ عينات من المسارات على فترات زمنية طويلة بما يكفي للتمييز بوضوح بين الجزيئات المرتبطة والجزيئات المنتشرة. الآن، اعرض بيانات الكاميرا للتحقق من إشارة الخلفية المظلمة.

قم بتشغيل ليزر 561 nanometer وتحقق من إشارة خلفية الاستثارة. قم بتشغيل ليزر 405 nanometer للتنشيط الضوئي لبروتينات Paul one PA M cherry المدمجة وزد الشدة حتى تظهر بقع فلورية للجزيئات المنفردة. الآن، اضبط زاوية حزمة الاستثارة لإضاءة مقطع رقيق فقط من العينة.

أغلق غطاء الشريحة. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن البروتينات الفلورية المفردة وتحديد موقعها بدقة، لذا سيكون المحاذاة والحساسية المثلى للمجهر أمرين حاسمين لجودة البيانات. ولتحقيق هذه الغاية، قم بتركيز شعاع الليزر في المستوى البؤري الخلفي لعدسة شيئية بقوة 100x وفتحة عددية 1.4.

يؤدي تحريك عدسة التركيز بشكل عمودي على الحزمة إلى إزاحة البؤرة بعيداً عن مركز الشيئية، مما يتسبب في خروج الحزمة من الشيئية بزاوية معينة. وجه الحزمة بحيث يتم تحقيق أقصى قدر من شدة الفلورة وتقليل الخلفية إلى أدنى حد. ابحث عن مجال رؤية جديد للخلايا في وضع مجهر الضوء النافذ وقم بضبط تركيز الصورة.

التقط صورة بالكاميرا لتسجيل حدود الخلايا. قم بتشغيل ليزر 561 nanometer وتبييض الفلورية الذاتية للخلايا والبقع الخلفية الموجودة على غطاء الشريحة لبضع ثوانٍ.

قبل البدء في عملية استحصال البيانات، ابدأ بتسجيل مقطع فيديو لـ palm تحت إثارة مستمرة بطول موجي 561 nanometer. قم بتشغيل ليزر 405 nanometer وزد الشدة تدريجياً على مدار المقطع وصولاً إلى one watt per square centimeter. تجنب استخدام شدات أعلى لليزر 405 nanometer لأنها تسبب التألق الذاتي للخلايا.

انتبه إلى كثافة الجزيئات الفلورية. من المهم الحفاظ على معدلات تنشيط منخفضة بحيث تكون البقع الفلورية معزولة بوضوح في كل إطار. قم بتسجيل حوالي 10,000 إطار لكل مقطع فيديو، وهو ما يستغرق عادةً ما يصل إلى ثلاث دقائق ويشغل ما يصل إلى جيجابايت واحد من مساحة القرص الصلب عند استخدام مجال رؤية مقصوص.

لاحظ أنه بمجرد تصوير مجال الرؤية، فإن فلوروفورات pa m cherry تخضع لعملية تبييض غير عكسية ولا يمكن ملاحظتها. ومرة أخرى، يستخدم الإجراء التالي برنامجاً مخصصاً في matlab. تظهر الفلوروفورات المفردة كدوال انتشار نقطي أو psfs.

في المقطع المرئي، يتم تحديد دوال انتشار النقطة (psfs) أولاً في صورة مصفاة بنطاق تمرير باستخدام نواة غاوسية بقطر سبعة بكسلات؛ حيث تتوافق المواضع المرشحة مع دوال انتشار النقطة (PSFs) التي تبلغ كثافة بكسلات ذروتها 4.5 أضعاف الانحراف المعياري للخلفية. ويعمل البكسل الأكثر سطوعاً موضعياً في كل PSF مرشح كتخمين أولي لملاءمة دالة غاوسية إهليلجية. أما معاملات الملاءمة الحرة فهي الموضع X، والموضع y، والعرض X، والعرض Y، وزاوية الدوران، والسعة، وإزاحة الخلفية.

يراعي القناع الغاوسي الإهليلجي حركة الجزيئات خلال وقت التعرض، الأمر الذي يؤدي إلى تمويه وتشويه مخطط دالة انتشار النقطة (PSF). وعند إسقاط تحديدات المواقع XY الناتجة من جميع إطارات فيلم الـ PALM على صورة مجهر الضوء النافذ لنفس المجال الرؤيوي، يجب أن تظهر تحديدات مواقع Paul one PAM Cherry ضمن المنطقة المركزية لخلايا E. coli. ويقوم التتبع الآلي بقياس حركة البروتينات، ولكن يعد الاختيار الموفق لنافذة التتبع أمراً بالغ الأهمية.

أولاً، قم بتشغيل خوارزمية التتبع لمجموعة من معاملات نافذة التتبع. ارسم عدد المسارات المقاسة لكل خلية مقابل نافذة التتبع لتحديد أصغر نافذة تتبع ممكنة لا تؤدي إلى تقسيم المسارات، ثم اعرض المسارات الناتجة على صورة مجهر الضوء النافذ لنفس مجال الرؤية. ولتصور التوزيع المكاني لحركة الجزيئات داخل الخلايا، يجب أن تظهر مسارات P one انتشاراً محصوراً داخل خلايا مفردة؛ فإذا بدا أن جزءاً من المسارات يعبر بين الخلايا، فإن ذلك يشير إلى أنه تم ربط جزيئات منفصلة عن طريق الخطأ لأن نافذة التتبع المختارة كانت كبيرة جداً و/أو لأن معدل التنشيط الضوئي كان مرتفعاً للغاية.

قم برسم التوزيع التراكمي لأطوال الخطوات بين التحديدات الموضعية المتتالية. يرتفع المنحنى ويتشبع بسلاسة عند استخدام نوافذ تتبع كبيرة بما يكفي، ولكنه يظهر حافة قطع إذا كانت النافذة المختارة صغيرة جدًا. وبمجرد اختيار نافذة تتبع مناسبة، يمكن تحليل خصائص الانتشار لـ Paul one.

احسب متوسط مربع الإزاحة (MSD) بين التحديدات الموضعية المتتالية لكل مسار يحتوي على إجمالي n من الخطوات، مع استخدام المسارات التي تحتوي على خمسة تحديدات موضعية على الأقل فقط لتقليل عدم اليقين الإحصائي لـ MSD. بعد ذلك، احسب معامل الانتشار الظاهري لكل مسار من خلال MSD. ويقوم الحد الثاني بتصحيح خطأ تحديد الموضع المقدر.

هذه هي قيم الحد الثاني. في هذا المثال، قم الآن برسم مخطط تكراري لقيم معامل الانتشار المقاسة من جميع المسارات في مجال الرؤية لـ pol one في الخلايا غير التالفة، ولـ pol one في الخلايا الخاضعة لمعالجة تلف DNA باستخدام MMS؛ حيث تحدد الأعمدة الحمراء مجموعة جزيئات pol one الفردية التي تبدو مرتبطة بالكروموسوم وتنتشر بسرعة تقل عن 0.15 square microns per second، بينما تتحرك الجزيئات التي تنتشر بحرية حول 0.9 square microns per second.

بعد تحديد جزيئات بول 1 (Pol 1) المرتبطة، يمكن تصور مواقع الارتباط في الخلايا غير التالفة وفي الخلايا التي تعرضت لتلف ناتج عن mm MS. وتوفر نسبة المسارات المرتبطة بالنسبة إلى إجمالي عدد المسارات الملحوظة مقياساً كمياً مباشراً لنشاط إصلاح الحمض النووي DNA الخاص بـ pol.

أُجري تنشيط ضوئي حي (in vivo) لبروتينات الاندماج pol one PA m cherry في خلايا e coli حية. يمكن أن يقتصر التنشيط الضوئي على فلوروفور PA m cherry واحد في خلية واحدة، بينما كشفت معدلات التنشيط الضوئي الأعلى عن وجود المزيد من الجزيئات الفلورية. كما أُجري تحليل التموضع لكل إطار من فيلم palm.

تم قياس الدقة باستخدام جزيئات غير متحركة في خلايا مثبتة أو جزيئات مرتبطة في خلايا حية، وتبين أنها تبلغ 40 nanometers بما يتفق مع التنبؤ النظري. بعد ذلك، تم ضبط حد تحديد الموقع عندما كان منخفضاً للغاية؛ حيث تم اختيار القمم العشوائية في ضجيج الخلفية بشكل خاطئ كمواقع مرشحة، بينما أدى رفع الحد بشكل مفرط إلى فقدان بعض البقع.

شغلت تموضعات Paul one الناتجة المنطقة المركزية من الخلية، مما يعيد تمثيل التنظيم المكاني للنواة في بكتيريا e coli بشكل عام. وتظهر غالبية مسارات Paul one في الخلايا غير التالفة انتشاراً. وتحتوي الخلية النموذجية على عدة مئات من مسارات Paul one بما يتوافق مع عدد النسخ الذي يبلغ حوالي 400 جزيء من Paul one لكل خلية e coli.

يمكن تحديد الأنواع المختلفة للحركة الجزيئية عن طريق حساب قيم MSD عبر نطاق من أزمنة التأخير؛ حيث تعطي الحركة الموجهة منحنى مكافئاً. وتتميز الحركة البراونية بخط مستقيم. أما منحنى الانتشار المقيد فيصل إلى مرحلة الاستقرار، ويمثل الإزاحة في منحنى MSD للجزيئات غير المتحركة درجة عدم اليقين في التحديد الموضعي.

ارتفع منحنى MSD الناتج لـ Paul one خطياً في أوقات التأخر القصيرة، مما يشير إلى الحركة البراونية، ثم وصل إلى حالة التشبع في أوقات التأخر الأطول بسبب حصر الخلية. وباستخدام هذه الطرق، تم قياس نشاط إصلاح DNA لـ Paul one استجابةً لتلف ألكلة DNA الخارجي في خلايا غير تالفة. ويظهر المدرج التكراري لمعامل الانتشار لـ Paul one وجود مجموعة سائدة من الجزيئات المنتشرة.

قد تشارك الجزيئات القليلة المرتبطة في تضاعف الحمض النووي DNA وإصلاح تلف DNA الداخلي تحت تأثير تلف مستمر بواسطة MMS بتركيز 100 millimolar. وتزداد بشكل ملحوظ وتيرة المسارات ذات معاملات الانتشار القريبة من الصفر. وهذا يدعم النموذج الذي يشير إلى ضرورة مشاركة المزيد من جزيئات Paul one في إصلاح DNA عند وجود المادة المطفِّرة باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى لتحليل البيانات، مثل التحديد الموضعي والتجميع، وذلك لقياس التوزيع المكاني للبروتينات في الخلية والبحث في وجود معقدات بروتينية أكبر تشارك في إصلاح DNA.