جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد النموذج الفيزيائي الصحيح الذي يصف ارتباط الجزيء الكبير بالترابط الخاص به وتحديد المعلمات الديناميكية الحرارية المرتبطة به. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير محلول مخزون من الجزيء الكلي أولا من خلال غسيل الكلى الشامل. ثم يتم إذابة الترابط محل الاهتمام في المخزن المؤقت النهائي لغسيل الكلى ويتم تحديد تركيزات جميع المكونات في الخطوة الثانية.

يتم تخفيف عينات الجزيئات الكبيرة والترابط بعناية إلى سلسلة من التركيزات المختلفة. بعد ذلك ، يتم إجراء سلسلة من كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة ، أو تجارب ITC بعدة تركيزات من كل من الترابط والبروتين لإنتاج سلسلة من متساوي الحرارة ITC في الخطوة الأخيرة من الإجراء. يتم إجراء التحليل العالمي لسلسلة التجارب باستخدام نماذج فيزيائية مختلفة ويتم تحديد النموذج الذي يعطي أفضل اتفاق شامل على أنه صحيح.

سأعرض لكم اليوم طريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الفيزيائية الحيوية مثل كيفية ربط جزيئات البروتين لروابطها ويمكن أن توفر مقاييس دقيقة لمعلمات الربط مثل الانتروبيا والانتروبيا وثوابت الارتباط قبل بدء هذا البروتوكول. تنقية البروتين محل الاهتمام الجزيء الكلي المستخدم في هذا العرض التوضيحي هو جليكوسيد N ستة رئيس مناعي ، وهو عبارة عن ترانسفيراز دقيق I أو C ستة أولي واحد I.To البدء ، وإعداد أربعة لترات من عازلة غسيل الكلى وتبريدها إلى أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بغسيل الكلى بحجم صغير من محلول الجزيئات الكبيرة.

في هذه الحالة ، خمسة ملليلتر من 400 ميكرومولار AAC C ستة أولي ، عين واحدة في 1.3 لتر من المخزن المؤقت لغسيل الكلى عند أربع درجات مئوية. يمكن القيام بذلك في غرفة باردة أو تبادل الثلاجة مع عازلة جديدة كل ثماني ساعات وغسيل الكلى ما مجموعه ثلاث مرات. احفظ محلول غسيل الكلى النهائي.

قم بتصفية 750 مل من محلول غسيل الكلى النهائي من خلال فلتر السليلوز 0.45 ميكرون وتخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية. سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت الذي يشار إليه الآن باسم المخزن المؤقت قيد التشغيل للشطف وكمخفف. بالنسبة للعينات ، اشطف جيدا مرشح حقنة 0.2 ميكرون مع عازلة قيد التشغيل.

ضع عينة البروتين والفلتر. اجمع العينة برفق في أنبوب مخروطي الشكل قبل تخزين محلول البروتين ، وحدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة البروتين القياسية. في هذه الحالة ، يتم قياس تركيز البروتين عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر ويتم حساب تركيز الإنزيم.

باستخدام معامل الانقراض الناتج عن خادم البروتينات EXI ، قم بتخزين البروتين بطريقة لزيادة الاستقرار على المدى الطويل. يجب تخزين AAC C ستة عين واحدة أولية عند أربع درجات مئوية لأنها لا تحتفظ بالنشاط بعد التجميد والذوبان بعد ذلك إذابة الترابط وتشغيل المخزن المؤقت. في هذا العرض التوضيحي ، تم إذابة أربعة ملليغرامات من إنزيم الأسيتيل أ في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الجاري لصنع محلول مخزون 25 ملليمول.

يمكن تخزين هذا الترابط عند 78 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للاستخدام لتحضير عينات ITC ، أولا ، احسب تركيز الإنزيم للحصول على قيمة C 64 كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ل AAC ستة أولي واحد I.هذا يتوافق مع تركيز 192 ميكرومولار. قم بإعداد محلول ملليلتر من الجزيء الكبير عند هذا التركيز ، وتخفيف محلول المخزون باستخدام المخزن المؤقت الذي يعمل يعمل بالفلتر FIA لتسوية الإنزيم المساعد ذوبان الجليد ، والإنزيم المساعد الأسيتال محلول في حمام ماء مثلج. بمجرد إذابة محلول الإنزيم المساعد الأسيتال ، احسب برفق تركيز محلول الترابط بضرب تركيز الجزيء الكبير في عدد مواقع الارتباط مضروبا في 10.

قم بإعداد محلول الإنزيم المساعد الأسيتيل عن طريق إضافة 80 ميكرولترا من الإنزيم المساعد ACE 25 ملليمولار ، وهو محلول مخزون ل 420 ميكرولتر من المخزن المؤقت والخلط. انقل محلول الإنزيم المساعد للأسيتيل المخفف إلى أنبوب تعبئة ماصة وأعد محلول المخزون المتبقي 25 مللي مولار إلى 78 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين. Degas A C ستة أولية عين واحدة وإنزيم مساعد دقيق ، محاليل A تحت الفراغ لمدة خمس دقائق عند 19 درجة مئوية ، أي درجة واحدة أقل من درجة حرارة التشغيل التجريبية المطلوبة.

لإعداد حقنة الحقن ، أدخل المحقنة من خلال حامل الحقنة حتى يصبح مشبك المحقنة المثبت على نفس ارتفاع الحامل. قم بتغذية مشبك المحقنة الثانية فوق حقنة الحقن حتى يتم ضغطها بقوة على الجزء السفلي من حامل المحقنة. شد المشبك برفق باستخدام محرك سداسي الحبر الجاف مقاس 0.05 بوصة.

بعد ذلك، ضع حامل الحقنة في حامل الماصة. حرك حاقن الماصة برفق في حقنة الحقن وتأكد من إدخال طرف المكبس مباشرة في فتحة المحقنة. بمجرد إدخاله بالكامل، قم بربط طوق القفل الخاص بحامل المحقنة في حاقن الماصة.

قبل تحميل محلول عينة بروتين العين A a C six prime one ، استخدم نظام غسيل الخلايا المرفق مع الأداة لغسل خلية العينة بما لا يقل عن 50 مل من المخزن المؤقت للتشغيل. قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي من خلية العينة عن طريق الشفط باستخدام حقنة زجاجية طويلة بإبرة 2.5 ملليلتر. قم بإزالة المحاليل من فراغ التفريغ باستخدام إبرة طويلة ونظيفة وجافة.

حقنة 2.5 ملليلتر. ارسم بعناية ما لا يقل عن 1.8 مل من عينة بروتين العين الواحدة A a C ستة في المحقنة. توخي الحذر لتجنب فقاعات الهواء.

بمجرد تحميل المحقنة بعينة البروتين ، أدخل الإبرة في خلية العينة ولمس الجزء السفلي من الخلية برفق. ارفع الإبرة ملليمترا واحدا تقريبا وحقن العينة برفق في الخلية حتى يظهر السائل الزائد فوق الجزء العلوي من خلية العينة. لطرد الخلية من أي فقاعات هواء محاصرة ، ارفع الإبرة بحوالي سنتيمتر واحد مع التأكد من بقاء المحلول في الفائض واسحب بسرعة وحقن ما يقرب من 0.25 مل من المحلول.

الآن حرك الإبرة برفق لأعلى على طول جانب الفائض. في العينة جيدا ، ستضرب الإبرة حافة. اسحب كل السائل فوق هذه الحافة لأن الحافة تشير إلى الارتفاع المطلوب للحل الجاري.

لتحميل حقنة الحقن ، قم بتوصيل حقنة الانتفاخ الأنبوبية البلاستيكية بمنفذ التعبئة وقم بخفض طرف المكبس إلى الجزء العلوي من منفذ التعبئة. الآن ضع أنبوب تعبئة الماصة لمحلول ترابط DGAs في الجزء السفلي من حامل الماصة. تأكد من أن طرف المحقنة لا يلمس الجزء السفلي من أنبوب التعبئة واسحب المحلول ببطء إلى المحقنة حتى تدخل كمية صغيرة إلى أنبوب حقنة التحميل.

بعد ذلك ، أغلق منفذ التعبئة عن طريق خفض طرف المكبس. يتم ذلك عن طريق النقر فوق زر إغلاق منفذ التعبئة. ثم لإزالة أي فقاعات هواء قد تكون محاصرة أثناء التحميل.

قم بالتطهير وإعادة التعبئة بالنقر فوق زر إعادة تعبئة التطهير. تطهير وإعادة تعبئتها ما مجموعه ثلاث مرات. بمجرد اكتمال عملية إعادة تعبئة التطهير، قم بإزالة أنبوب التعبئة من حامل الماصة وامسح طرف المحقنة برفق بمناديل مختبرية.

الآن قم بخفض حقنة مجموعة الماصة في العينة. حسنا ، توخي الحذر والمضي قدما ببطء لأن الإبرة يمكن أن تنحني بسهولة. تأكد من إدخال المحقنة بالكامل عن طريق الضغط لأسفل على قاعدة طوق القفل.

بمجرد تأمين المحقنة ، اضبط درجة حرارة التشغيل المطلوبة وحدد طاقة مرجعية أكبر قليلا من الحد الأقصى لتدفق حرارة الحقن المتوقع. في هذا المثال ، يتم استخدام 20 درجة مئوية و 20 ميكرو سعرة حرارية في الثانية كدرجة حرارة تشغيل وقوة مرجعية على التوالي. ثم قم ببرمجة أحجام الحقن المطلوبة والتأخير.

هنا ، يتم استخدام 28 حقنة بحجم الأول ميكرولتر وتأخير 62 والحقن اللاحقة بحجم 10 ميكرولتر مع تأخير 332. توفر التجربة الموضحة هنا الأساس لإنشاء مجموعة بيانات بتركيز واحد لتوليد المنحنيات الإضافية اللازمة. كرر هذه العملية مع تقليل تركيزات الجزيئات الكبيرة والرابطة.

تأكد من أن جميع عينات الجزيئات الكبيرة والترابط تنشأ من نفس محلول المخزون لتقليل الخطأ في التركيزات. يظهر هنا أثر كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة الخام الناتج عن معايرة الإنزيم المساعد أيتيل أ 3.86 مللي مولار إلى 192 ميكرومولار من الجزيء الصغير. أ أ ج ستة أولي واحد.

تم استخدام القيم المتكاملة للعين لتحديد معلمات الربط بملاءمة متسلسلة من الموقعين. يصور هذا الرسم البياني متساوي الحرارة الناتج عن ITC لتركيزات متنوعة من الإنزيم المساعد ACE A و AAC C ستة Prime One Eye. كانت البيانات التجريبية التي تمثلها الدوائر المفتوحة مناسبة لكل من مجموعتين من النموذج المستقل للمواقع ، ونموذج تسلسلي لموقعين.

ينظر إلى اتفاق أفضل مع النموذج المتسلسل للموقعين. يتم تحديد تركيزات البروتين المستخدمة في النص المصاحب. عند إجراء هذا الإجراء ، من المهم أن تكون دقيقا جدا في التخفيف لأن التغيير في التركيزات يمكن أن يكون له تأثير كبير على نتائجك.