عزل الخلايا المستهدفة القائمة على الأسلاك الوظيفية: تقنية خارج الجسم الحي لعزل الخلايا السرطانية من الدم المحيطي المسنن

جزيئات التصاق الخلايا الظهارية ، أو EpCAMs ، هي بروتينات سكرية عبر الغشاء السطحية يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الخلايا الظهارية سريعة التكاثر في سرطانات البروستاتا. لعزل الخلايا الشفرة عن EpCAM ، ابدأ بسلك طبي يحمل طرفا وظيفيا مطلي بالذهب. طبقات وظيفية عبارة عن هلام بوليمري يحتوي على أجسام مضادة خاصة ب EpCAM مرتبطة تساهميا.

اغمر السلك في معلق دم محيطي يحتوي على خلايا سرطانية مصنفة بالفلورسنت. تأكد من أن الجزء الوظيفي يظل مغمورا في معلق الدم. تتعرف EpCAMs على الخلايا السرطانية وترتبط بأجسامها المضادة المحددة التي تعمل على السلك.

اغسل بمخزن مؤقت لإزالة أي خلايا غير مرتبطة من سطح السلك. قم بثني السلك وتثبيته على شريحة زجاجية تحتوي على عازلة ، مع غمر الجزء الوظيفي في المخزن المؤقت. استخدم المجهر الفلوري للتحقق من التألق الساطع من سيتوبلازم الخلية والنوى وتأكيد وجود الخلايا الملتقطة على السلك.

عالج السلك بمخزن مؤقت للتحرير. تشق الإنزيمات المحللة للبروتين في المخزن المؤقت الهلام البوليمري ، وتطلق مجمعات خلايا الأجسام المضادة السرطانية في المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمجموعة الأسلاك لجمع مجمعات خلايا الأجسام المضادة المنبعثة في الحبيبات. قم بإزالة السلك والمادة المطفية المحتوية على الإنزيم. أعد تعليق الحبيبات المحتوية على الخلية المستهدفة في وسط مناسب.

في 5 ملليلتر من الدم المحيطي ، أضف حوالي 500 إلى 500,000 خلية ثم اخلطها عن طريق قلب الأنبوب. بعد إزالة السلك من حجرة التخزين ، قم بإزالة الغطاء المطاطي الذي يحمل السلك واغسل السلك بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x وقم بتثبيته في غطاء الأنبوب. بعد ذلك ، قم باحتضان الأنبوب على خلاط أسطواني مائل بمعدل 5 دورات في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اشطف السلك في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتخزين السلك في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات في الظلام.

ارسم منطقة مستطيل على شريحة زجاجية باستخدام قلم شحوم وأضف 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x عليها. لغمر الجزء الوظيفي من السلك في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، قم بثني الجزء غير الوظيفي من السلك وضعه على الشريحة الزجاجية. لحساب عدد الخلايا الملتقطة ، افحص جانبي السلك بصريا. بعد الفحص ، انقل السلك مرة أخرى في أنبوب سعة 15 مليلتر مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x واحتفظ به في الظلام.

في 1 مليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، قم بإذابة 4 ملليغرام من مكون المخزن المؤقت للتحرير. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر للحصول على المخزن المؤقت الجاهز للاستخدام. بعد ذلك ، قم بتسخين المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بمجرد تسخينه ، انقل 1.6 مل من المخزن المؤقت للتحرير لملء أنبوب تفاعل سعة 1.5 مليلتر بالكامل. بعد ذلك ، احتضان الجزء الوظيفي من السلك في المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، ضع السلك على شاكر بمعدل 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للسلك عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزاحة السلك من الأنبوب ، وأغلق الغطاء ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.