عزل الخلايا المستهدفة القائمة على الأسلاك الوظيفية: تقنية خارج الجسم الحي لعزل الخلايا السرطانية من الدم المحيطي المسنن

جزيئات التصاق الخلايا الظهارية ، أو EpCAMs ، هي بروتينات سكرية عبر الغشاء السطحية يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الخلايا الظهارية سريعة التكاثر في سرطانات البروستاتا. لعزل الخلايا الشفرة عن EpCAM ، ابدأ بسلك طبي يحمل طرفا وظيفيا مطلي بالذهب. طبقات وظيفية عبارة عن هلام بوليمري يحتوي على أجسام مضادة خاصة ب EpCAM مرتبطة تساهميا.

اغمر السلك في معلق دم محيطي يحتوي على خلايا سرطانية مصنفة بالفلورسنت. تأكد من أن الجزء الوظيفي يظل مغمورا في معلق الدم. تتعرف EpCAMs على الخلايا السرطانية وترتبط بأجسامها المضادة المحددة التي تعمل على السلك.

اغسل بمخزن مؤقت لإزالة أي خلايا غير مرتبطة من سطح السلك. قم بثني السلك وتثبيته على شريحة زجاجية تحتوي على عازلة ، مع غمر الجزء الوظيفي في المخزن المؤقت. استخدم المجهر الفلوري للتحقق من التألق الساطع من سيتوبلازم الخلية والنوى وتأكيد وجود الخلايا الملتقطة على السلك.

عالج السلك بمخزن مؤقت للتحرير. تشق الإنزيمات المحللة للبروتين في المخزن المؤقت الهلام البوليمري ، وتطلق مجمعات خلايا الأجسام المضادة السرطانية في المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمجموعة الأسلاك لجمع مجمعات خلايا الأجسام المضادة المنبعثة في الحبيبات. قم بإزالة السلك والمادة المطفية المحتوية على الإنزيم. أعد تعليق الحبيبات المحتوية على الخلية المستهدفة في وسط مناسب.

في 5 ملليلتر من الدم المحيطي ، أضف حوالي 500 إلى 500,000 خلية ثم اخلطها عن طريق قلب الأنبوب. بعد إزالة السلك من حجرة التخزين ، قم بإزالة الغطاء المطاطي الذي يحمل السلك واغسل السلك بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x وقم بتثبيته في غطاء الأنبوب. بعد ذلك ، قم باحتضان الأنبوب على خلاط أسطواني مائل بمعدل 5 دورات في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اشطف السلك في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتخزين السلك في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات في الظلام.

ارسم منطقة مستطيل على شريحة زجاجية باستخدام قلم شحوم وأضف 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x عليها. لغمر الجزء الوظيفي من السلك في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، قم بثني الجزء غير الوظيفي من السلك وضعه على الشريحة الزجاجية. لحساب عدد الخلايا الملتقطة ، افحص جانبي السلك بصريا. بعد الفحص ، انقل السلك مرة أخرى في أنبوب سعة 15 مليلتر مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x واحتفظ به في الظلام.

في 1 مليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، قم بإذابة 4 ملليغرام من مكون المخزن المؤقت للتحرير. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر للحصول على المخزن المؤقت الجاهز للاستخدام. بعد ذلك ، قم بتسخين المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بمجرد تسخينه ، انقل 1.6 مل من المخزن المؤقت للتحرير لملء أنبوب تفاعل سعة 1.5 مليلتر بالكامل. بعد ذلك ، احتضان الجزء الوظيفي من السلك في المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، ضع السلك على شاكر بمعدل 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للسلك عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزاحة السلك من الأنبوب ، وأغلق الغطاء ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.