تعطيل الجينات المستهدفة المستندة إلى نظام CreER-LoxP: نظام إعادة تركيب Cre المحفز للتاموكسيفين للضربة القاضية للجين المستهدف في نموذج الفأر

ابدأ بنموذج فأر معدل وراثيا يشتمل على جينوم معدل يؤوي مواقع LoxP - تسلسلات محددة معترف بها بواسطة إنزيمات Cre-recombinase - تحيط بالجين محل الاهتمام. يتم نقل الفأر أيضا باستخدام ناقل بلازميد يشفر إعادة تركيب CreER الخاص بالأعضاء ، مما يؤدي إلى دمج عنصر Recombinase CreER في جينوم خلايا الكبد.

يتفاعل CreER recombinase المعبر عنه ، وهو بروتين اندماج غير نشط يتضمن Cre recombinase ومجال ربط الترابط المتحور لمستقبلات هرمون الاستروجين ، ER ، ويرتبط ببروتين الصدمة الحرارية في السيتوبلازم. يحصر هذا الارتباط CreER recombinase في السيتوبلازم.

تحضير محلول تاموكسيفين ، وهو دواء كاره للماء ، باستخدام الإيثانول والزيت المناسب. الآن ، قم بحقن محلول تاموكسيفين داخل الصفاق في الربع السفلي الأيسر من بطن الفأر لمنع تلف أعضاء البطن.

يتم استقلاب عقار تاموكسيفين المحقون في الكبد إلى 4-هيدروكسي تاموكسيفين ، 4-OHT. علاوة على ذلك ، يرتبط 4-OHT ، وهو معدل مستقبلات هرمون الاستروجين الانتقائي ، بمجال ربط ER-ligand الخاص ب CreER recombinase ، مما يتسبب في تغييره التوافقي. هذا يؤدي إلى إطلاق CreER recombinase من بروتين الصدمة الحرارية.

ينتقل CreER المنشط إلى النواة ويتعرف على مواقع LoxP في جينوم المضيف. يحفز CreER إعادة التركيب الخاصة بالموقع بين مواقع LoxP ، مما يؤدي إلى استئصال الجين محل الاهتمام ، وبالتالي تحقيق ضربة قاضية للجينات الخاصة بالأنسجة.

بدء تحريض Cre Recombinase بعد 10 إلى 15 يوما من حقن وريد الذيل ، للسماح بإزالة النواقل غير المتكاملة. قم بإذابة 10 ملليغرام من تاموكسيفين في 40 ميكرولتر من الإيثانول ، واحتضانه عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع الرج.

دوامة عدة مرات حتى يذوب التاموكسيفين ، ثم أضف 960 ميكرولتر من زيت الذرة ، واحتضن لمدة 5 دقائق عند 55 درجة مئوية. بعد التبريد ، اسحب المحلول في حقنة أنسولين سعة 1 مليلتر بإبرة قياس 20 ، ثم قم بتغييرها إلى إبرة قياس 27.

للحقن ، أولا ، قم بتقطيع الماوس عن طريق الإمساك برقبة الماوس بعناية بالإبهام والإصبع الثاني ، وتثبيت الذيل بين قاعدة اليد والإصبع الرابع والخامس ، ثم قم بحقن 0.1 مل من المحلول داخل الصفاق في الربع السفلي الأيسر من البطن.