التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الجزيئات الحيوية مثل الحمض النووي والبروتينات في مخازن مائية في الوقت الفعلي باستخدام مجهر القوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الجزيئات الحيوية أولا ليتم تصويرها. بعد ذلك ، يتم إعداد مجهر القوة الذرية ووضع مسبار ناتئ FM.

ثم يتم تصوير سطح العينة والجزيئات الحيوية ذات الأهمية وتحليلها. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الحجم العام وكمية وتنظيم الحمض النووي والبروتينات والمجمعات الجزيئية الحيوية غير المتجانسة في ظروف مخزنة من خلال الفحص المجهري للقوة الذرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المرافق الجزيئي ، مثل ما هي هندسة STO للمرافقات والمرافقات المعقدة للعميل.

العرض المرئي للبروتين لهذه الطريقة مفيدا حيث قد يكون من الصعب تعلم خطوات تحضير مسبار ذراع A FM و Kent من التعليمات المطبوعة إلى حد كبير بسبب التعقيدات المرتبطة بالتلاعب الجسدي. سيوضح الإجراء مورغان شانون وجون جيرتز ، وهما طالبان من مختبري للبدء في عزل جزيئات البروتين أو الحمض النووي المراد تصويرها وتعليقها في مخزن مؤقت مائي. بعد التأكد من نقاء العينة ، قم باحتضانها في مخزن مؤقت لامتصاص FM على الجليد لتعزيز التصاق العينة بالميكا.

بالنسبة لعينات البروتين ، استخدم مخزن مؤقت 10 مللي مولار. وبالنسبة للمغنيسيوم الحمض النووي الذي يحتوي على مخزن مؤقت يتكون من 10 ملليمولار تريس ، درجة الحموضة 7.5 10 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، كلوريد المغنيسيوم ملليمولار مناسبان لتركيب مسبار A FM. ضع حامل مسبار الخلية السائلة على محطة إرساء تركيب الكابولي المقابلة.

حدد موقع الكابول السميك الطويل لمسبار ذراع النيتريد الحاد لاستخدامه في التصوير. انقله بعناية إلى حامل مسبار الخلية السائلة ، مع التأكد من بقاء الطرف في وضع مستقيم. بعد ذلك ، افحص الكابولي تحت المجهر الضوئي للتأكد من أنه سليم ومثبت بشكل صحيح في حامل مسبار الخلية السائلة.

ثم قم بإزالة رأس FM بعناية من مجموعة تتوافق الأداة عن طريق شد برغي مشبك الرأس العصبي. اقلب رأس FM وادفع بقوة حامل مسبار الخلية السائلة على المسامير الأربعة الموجودة في قاعدة رأس FM. أخيرا ، أعد رأس FM بعناية إلى أداة تجميع الذيل.

لمزيد من إعداد FM قبل عينات التصوير ، حرك مقابض المجهر الضوئي الموجود على متن الطائرة لتحديد موقع طرف الكابولي ، واضبط السهمين لأعلى ولأسفل لوحدة التحكم في البصريات على البرنامج لتركيز طرف الكابول. استخدم مقابض ضبط الليزر لمحاذاة الليزر مع طرف الكابول. هذه واحدة من أكثر الخطوات تحديا من الناحية الفنية في البروتوكول يتم تحديد المواقع يدويا ويتطلب تعديلا دقيقا للمقبض.

المراقبة الدقيقة لليزر في بقعة الانعكاس وبقعة الإضاءة من احتمالية المحاذاة الناجحة. بعد ذلك ، اضبط مقابض كاشف الصور على رأس FM لتوسيط كاشف الصور. ضع ورقة مشقوقة حديثا من MICA متصلة بمعدن قرص عينة FM على حامل العينة الممغنطة فوق لوحة حامل FM.

قم بتدوير لوحة حامل FM بحيث يتم وضع قرص العينة للتصوير الأولي. استخدم التحكم في سطح التركيز البؤري لبرنامج الجهاز لتحريك رأس FM لأسفل باتجاه سطح قرص عينة MICA. حتى يتم التركيز على الميزات المميزة على سطح MICA أو انعكاس الطرف، حدد أيقونة الضبط من برنامج الآلة وقم بضبط الكابولي.

تردد الرنين لمسبار MSNL أو SNL الموصى به هو 20 إلى 60 كيلو هرتز. حدد إزاحة ذروة 5٪ لتصوير عينة MICA. أولا ، قم بتعطيم المسبار على سطح MICA ، وقم بتعيين حجم المسح الأولي إلى 10 ميكرومتر ومعدل المسح إلى هرتز واحد.

التقط صورا كاملة للمسح الضوئي لحقل 10 ميكرومتر. ثم قم بتقليل حجم المسح إلى خمسة واحد و 0.5 ميكرومتر والتقط صورا كاملة لكل حقل. قم بفك ارتباط المسبار بالنقر مرة واحدة على أيقونة فك الارتباط في برنامج الأداة.

لتصوير الجزيئات الحيوية ذات الأهمية ، امزج خمسة ميكرولترات من العينة المحضرة مع 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت للامتصاص الجديد. أضف بعناية 50 ميكرولترا من 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر من الجزيء الحيوي المحتوي على محلول مباشرة على سطح وحدة العناية المركزة للأطفال. توقف مؤقتا لمدة خمس دقائق للسماح للجزيئات الحيوية في العينة بالالتصاق بسطح ميكا.

ثم قم بإدخال 50 إلى 100 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت للامتصاص في حامل مسبار الخلية السائلة. احرص على عدم لمس المسبار أو رأس FM أو MICA بطرف الماصة ، وأعد ضبط كاشف الصور وأعد محاذاة الليزر مع الكابول حسب الضرورة. ثم استخدم برنامج الأداة لإعادة إشراك المسبار.

قم بزيادة حجم الفحص لتحديد مناطق الاهتمام. بمجرد اكتمال التصوير ، حدد رمز السحب على برنامج الجهاز عدة مرات لفك ارتباط المسبار. أخيرا ، استخدم الماء المقطر لشطف حامل مسبار الخلية السائلة وقرص العينة جيدا.

ثم جربه بالهواء المضغوط. يظهر هنا مثال على صورة A FM. توفر ركيزة الميكا سطحا مستويا جزيئيا يمكن أن يمتص عليه الحمض النووي والبروتين.

يوفر تصوير MICA قبل عينات الجزيئات الحيوية تحكما سلبيا وتقييما لضوضاء التصوير. كما أنه يوفر مستوى من التأكيد على أن الكابول قد تم ضبطه بشكل صحيح وأن تصوير العينة اللاحق سيكون ناجحا. يتم التعرف على الحمض النووي للبلازما المزدوجة التي تقطعت بهم السبل من المفترض أن يكون ملفوفا للغاية بسهولة من خلال مظهره غير المتماثل وترسبه المنتظم على ركيزة ميكا التي لم تكن ملحوظة سابقا.

أيضا تمييز مجمعات البروتين ذات أحجام الجسيمات المنفصلة بشكل فريد عن ركيزة ميكا. تشير الاختلافات في حجم الجسيمات إلى عدم تجانس العينة ويمكن أن تكون مفيدة لتقريب البروتين أو الهندسة الرواقية المعقدة أو النشاط الكيميائي الحيوي. الشكل القطري العام والاتجاه المتسق لجزيئات البروتين التي لوحظت.

فيما يلي قطعة أثرية للتصوير حيث من المتوقع توجيه البروتينات على ركيزة ميكا بطريقة عشوائية. الأسباب المحتملة للقطعة الأثرية المرصودة أو شذوذ الطرف المادي أو تصوير FM بمعدل مسح سريعين بينما يمنع الالتفاف الطرف حسابات قياس الطول المطلق في قياس ارتفاع المحور x و Y أو المحور Z والقياسات النسبية X و Y قد تكون مفيدة مع ذلك لتقدير الخصائص الفيزيائية الحيوية للجزيئات الحيوية المصورة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضبط الكابولي بدقة ومحاذاة كاشف الصور باتباع هذا الإجراء الأساسي FM.

يمكن إضافة خطوات أخرى ، بما في ذلك استخدام خلية سائل التبادل العازلة ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل قدرة المرافقين الجزيئيين على التأثير على إطلاق مستقبلات الستيرويد من عناصر استجابة الحمض النووي الخاصة بهم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية تصوير بروتينات الحمض النووي والمجمعات الجزيئية الحيوية باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية في ظروف مخزنة.