تصور تنشيط الكاسباز في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية

في الخلايا المناعية ، يعد كاسباز -1 ، وهو كاسباز التهابي ، مكونا رئيسيا مستجيبا للمناعة موجود في شكل غير نشط. تتكون هذه الأشكال غير النشطة من مجال مؤيد مدمج مع مجال تحفيزي وتصبح نشطة عن طريق التثمير الناجم عن القرب.

لتصور تنشيط الكاسباز في الجسم الحي ، ابدأ بثقافة البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية المنقولة التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الحمراء وزوج من بروتينات مراسل تكميل الفلورسنت. تحتوي بروتينات المراسل على مجال مؤيد من كاسباز -1 مدمج مع شظايا غير فلورية من بروتين كوكب الزهرة ، إما Venus-N أو Venus-C.

عالج الخلايا بوسيط تصوير يحتوي على عديدات السكاريد الدهنية — منبه التهابي مشتق من البكتيريا، وأيونوفورات البوتاسيوم — النيجيريسين.

تتفاعل عديدات السكاريد الدهنية مع مستقبلات التعرف على الأنماط على البلاعم ، مما يؤدي إلى تجميع مركب التهابي.

تدخل جزيئات النيجيريسين إلى الخلية وترتبط بأيونات البوتاسيوم ، مما يتسبب في تدفقها إلى الوسط خارج الخلية وتقليل تركيز أيونات البوتاسيوم داخل الخلايا. يؤدي هذا إلى تحضير بروتينات مستشعر الالتهابات ببروتينات محول - وهو بروتين سد بين بروتين المستشعر و procaspase-1 ، لتشكيل المجمع.

تتفاعل المجالات المؤيدة التي تحتوي على شظايا كوكب الزهرة مع بروتينات محول المجمع. هذا يجعل الجزأين على مقربة ، مما يجبرهما على التراجع والتألق.

تصور الخلايا تحت مجهر التألق.

تظهر الخلايا المنقولة باللون الأحمر مع بقع مضان خضراء ، مما يؤكد تنشيط الكاسباز.

خذ أنبوبا صغيرا معقما سعة 1.5 ملليلتر لكل تعداء ، وأضف بلازميد المراسل المناسب وبلازميدات كاسباز BiFC في الغطاء. ضع محطة الماصة والجهاز والأطرافا وأنابيب التثقيب الكهربائي والماصة في غطاء تدفق رقائقي معقم. قم بتوصيل وتشغيل جهاز النواة.

أدخل معلمات التعدي في شاشة بدء التشغيل المعروضة. اضغط على الجهد ، وأدخل 1,000 ، واضغط على تم لضبطه على 1000 فولت. اضغط على العرض ، وأدخل 40 ، واضغط على تم لضبط النبضة على 40 مللي ثانية. أخيرا ، اضغط على # نبضات ، وأدخل اثنين ، واضغط على تم لضبط عدد النبضات الكهربائية على 2.

خذ أحد أنابيب التثقيب الكهربائي واملأه بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت الإلكتروليتي E في درجة حرارة الغرفة. أدخل أنبوب التثقيب الكهربائي في حامل الماصة في محطة الماصة، مع التأكد من أن القطب الكهربائي الموجود على جانب الأنبوب متجها للداخل، ويسمع صوت نقرة عند إدخال الأنبوب.

خذ حبيبات الخلية وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت R لإعادة التسخين مسبقا لكل 1 إلى 2 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة ، واخلطها برفق باستخدام ماصة دقيقة P20. أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل أنبوب تعداء ، واخلطه برفق باستخدام ماصة دقيقة P20. أدخل طرفا في الماصة بالضغط على زر الضغط على المحطة الثانية، للتأكد من أن المشبك يلتقط جذع تثبيت المكبس في الطرف تماما.

بعد ذلك، اضغط على زر الضغط على الماصة حتى المحطة الأولى، واغمس في الأنبوب الأول الذي يحتوي على خليط الخلية أو البلازميد لشفط العينة. أدخل الماصة مع العينة بعناية فائقة في حامل الماصة، مع التأكد من أن الماصة تنقر ووضعها بشكل مناسب. اضغط على ابدأ على شاشة اللمس ، وانتظر حتى يتم توصيل النبضات الكهربائية.

بإزالة الماصة ببطء من المحطة ، وأضف على الفور تعليق الخلية المنقولة إلى البئر المقابل مع الوسط المسخن مسبقا والخال من المضادات الحيوية عن طريق الضغط ببطء على زر الضغط إلى المحطة الأولى. هز اللوحة برفق بالخلايا المنقولة ، واحتضن لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا إلى كل بئر.

ضع الطبق في الحاضنة ، واترك 24 ساعة على الأقل للتعبير الجيني. في اليوم التالي ، افحص صلاحية الخلية وكفاءة التعدي باستخدام مجهر اللفائف الفلوري.

قم بإزالة الوسائط من الخلايا بعناية باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحفيز أسفل جانب البئر. لتشغيل آبار التحكم غير المعالجة ، أضف وسيط تصوير بدون المنبه.

لتصور الخلايا باستخدام مجهر متألق أو مجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل المجهر ومصدر ضوء الفلورسنت ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. حدد الهدف 10 مرات أو 20 مرة ، وضع طبق الثقافة على مرحلة المجهر.

ابحث عن الخلايا الموجودة أسفل مرشح 568 نانومتر باستخدام العدسة ، وركز على الخلايا التي تعبر عن الخلايا الحمراء للمراسل. عد جميع الخلايا الحمراء في المجال البصري. أثناء وجودك في نفس المجال المرئي ، قم بالتغيير إلى عوامل التصفية 488 أو 512. احسب عدد الخلايا الحمراء الخضراء أيضا. عد ما لا يقل عن 100 خلية حمراء من ثلاثة حقول على الأقل.