مختبر تقنيات العقيم: طرق تصفيح

[راوي] يشتمل هذا البروتوكول على تقنية معقمة في طرق الطلاء المستخدمة لعزل أو نشر أو تعداد الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا والعاثيات. تشمل الإجراءات الثقافات البكتيرية المطلية بخط لعزل مستعمرات مفردة. صب الطلاء لتحديد تركيز البكتيريا. وانشر الطلاء لتعداد المستعمرات البكتيرية القابلة للحياة. تستخدم تراكبات الأجار الناعمة لعزل العاثيات وتعداد اللويحات أثناء نقل خلايا الطلاء المتماثلة من لوحة إلى أخرى في نمط مكاني متطابق. في النهاية ، تتراوح التطبيقات العملية لهذه التقنيات لزراعة الكائنات الحية الدقيقة من تحديد البكتيريا في البيئات إلى التقدم التكنولوجي في علم الوراثة الجزيئية والمقايسات الحيوية عالية الإنتاجية.

- بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في طرق الطلاء هذه لأن التلاعب يتطلب حركات دقيقة ومنسقة لتجنب ملامسة الأسطح غير المعقمة. يتطلب تعلم هذه الإجراءات الروتينية التدريب والممارسة. سيوضح الإجراءات منسق المختبر الخاص بي ، الدكتور كريس ريدي.

- [الراوي] ابدأ العمل مع الكائنات الحية الدقيقة من خلال معرفة قواعد المختبر واحتياطات السلامة بما في ذلك تصنيف المخاطر البيولوجية وإزالة تلوث النفايات والتخلص منها. تأكد من أن جميع الأدوات والحلول والوسائط الخاصة بإجراءات الطلاء معقمة. قم أيضا بإنشاء مساحة عمل واضحة. نظفه بمطهر. قم بإعداد موقد بنسن بأنبوب متصل بخط غاز ، وقم بترتيب الإمدادات اللازمة بالمواد المصنفة بشكل صحيح. استمر في غسل اليدين جيدا بالصابون المطهر والماء الدافئ. أولا ، بلل يديك بالماء الدافئ الجاري ثم ضع الصابون ووزعه جيدا. فرك اليدين بقوة مما يؤدي إلى احتكاك على جميع الأسطح بما في ذلك الإبهام وظهر الأصابع وظهر اليدين وتحت الأظافر. ثم اشطفها جيدا لإزالة الصابون المتبقي وجففها باستخدام مناشف ورقية موزعة من الحامل. أخيرا ، باستخدام منشفة ورقية جديدة ، أغلق الصنبور. تم تصميم إجراء لوحة الخط لعزل الثقافات النقية للبكتيريا أو المستعمرات عن التجمعات المختلطة عن طريق الفصل الميكانيكي البسيط. قم بإزالة طبق أجار من صندوق بارد أربع درجات مئوية وقم بتسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة. حدد أداة من مجموعة الأدوات لخطوط اللوحة. تأكد من جفاف اللوحة دون تكاثف على الغطاء. قم بتسمية الجزء السفلي من لوحة أجار حول الحافة. عندما تكون بارعا ، استخدم لوحة واحدة لعينات متعددة. ثم أشعل موقد بنسن لإشعال الحلقة المعدنية. ابدأ من ثلاث إلى أربع بوصات من الحلقة المعدنية بالسلك الموجود في طرف المخروط الأزرق ، وهو الجزء الأكثر سخونة من لهب موقد بنسن. عندما يصبح المعدن ساخنا باللون الأحمر ، حرك السلك حتى يقترب اللهب من الحلقة. لتبريد الحلقة ، المس حافة وسط الأجار مما يولد صوتا أزيزا. استمر في التقاط اللقاح على الحلقة. ارفع النصف السفلي من اللوحة. حرك الحلقة ذهابا وإيابا من الحافة إلى المركز في الربع الأول من اللوحة. ضع اللوحة المقلوبة مرة أخرى على الغطاء. أعد لهب الحلقة المعدنية. اقلب طبق بتري 90 درجة. المس الحلقة بالقرب من نهاية الخط الأخير باستخدام نمط الخلف وللأمام ، وتقاطع النصف الأخير من الخطوط في الربع الأول ، ثم انتقل إلى الربع الثاني الفارغ. بمجرد ملء الربع الثاني ، ضع اللوحة. كرر إجراء الخطوط للربعين الثالث والرابع مع تجنب ملامسة الربع الأول. للخطوط باستخدام عود أسنان معقم ومسطح ، أمسك الطرف الضيق برفق بين الإبهام والإصبع الدائري بزاوية 10 إلى 20 درجة إلى الوسط ، واستخدم الطرف العريض لرسم الأرباع. اقلب اللوحة مرة أخرى على الغطاء بين الأرباع وتخلص من عود الأسنان بشكل مناسب. استمر في احتضان الألواح المخططة رأسا على عقب. يعدد إجراء لوحة الصب العدد الإجمالي لوحدات تشكيل المستعمرة على سطح وداخل أجار لوحة واحدة. اضبط مؤقتا لمدة 10 دقائق ثم انقل 18 مل من وسط الأجار المذاب من حمام مائي 55 درجة مئوية إلى كتلة حرارية 48 درجة مئوية وقم بالتوازن لمدة 10 دقائق. قم بتسمية قاع طبق بتري معقم. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتضمين عامل التخفيف. الآن قم بتوزيع مليلتر واحد من العينة في منتصف طبق بتري. أغلق الغطاء. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الأجار المذاب وقم بتمرير حافة الأنبوب المفتوح عبر اللهب. صب الأجار بعناية في طبق بتري. أغلق الغطاء ثم امزج العينة مع الأجار عن طريق تحريك الطبق برفق. انتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للأجار بالتصلب. بمجرد أن يصلب الأجار ، اقلب الطبق وضعه في غرفة دافئة. يهدف الطلاء المنتشر إلى فصل الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في حجم عينة صغير ، وتوزيع المستعمرات الناتجة بالتساوي عبر سطح الأجار. قم بموازنة الطبق مع درجة حرارة الغرفة وقم بتسميته بشكل مناسب. ضع اللوحة على القرص الدوار. ماصة 0.1 مل من العينة على مركز الأجار وأغلق الغطاء. أخرج الطرف في حاوية النفايات. اغمس القضيب المعدني في دورق من 70٪ من الإيثانول يغطي الجزء السفلي بالكامل من الموزعة والبوصة الأولى من الساق ثم صفيها. أشعل الإيثانول الزائد عن طريق المرور عبر لهب موقد بنسن. بعد ذلك ، افتح غطاء لوحة الأجار وقم بتبريد الموزعة عن طريق لمسها إلى الأجار على طول الحافة بالقرب من الحافة. تدور القرص الدوار ببطء. أمسك الموزعة برفق على سطح أجار ، وقم بتوزيع العينة تدريجيا بالتساوي على اللوحة بأكملها باستخدام حركة ذهابا وإيابا أثناء دوران القرص الدوار. أغلق الغطاء واترك العينة تمتص جيدا لمدة خمس دقائق على الأقل. ثم احتضان اللوحة المقلوبة. أولا ، قم بتسمية لوحة الأجار بشكل مناسب. افتح غطاء لوحة الأجار. ثم افتح حاوية الخرز الزجاجي المعقم مسبقا وقم بإشعال الحافة. قم بتوزيع 10 إلى 12 حبة زجاجية معقمة بحذر على طبق أجار. أغلق غطاء اللوحة وأشعل حافة حاوية الخرزة الزجاجية قبل استبدال الغطاء. الآن ، قم بتقطيع العينة إلى مركز أجار. في حركة أفقية ، هز الخرزات برفق عبر سطح الأجار سبع مرات. إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ، يبدو الإجراء وكأنه هز ماراكاس. قم بتدوير اللوحة 60 درجة ورجه أفقيا مرة أخرى سبع مرات. مرة أخرى ، قم بتدوير اللوحة 60 درجة وكرر الرج. تحقق من امتصاص العينة. بعد ذلك ، اسكب الخرزات الملوثة في دورق تجميع مميز يحتوي على 10٪ مبيض الكلور. احتضان اللوحة المقلوبة. يستخدم اختبار البلاك بشكل شائع للكشف عن عاثيات البكتيريا وتحديدها. استزراع البكتيريا المؤشرة في المرحلة الأسية وتخزينها على الجليد. بعد ذلك ، قم بتسمية أنبوبين معقمين للطرد المركزي الدقيق والتحكم وإضافة 50 ميكرولترا من عينة العاثية أو المخزن المؤقت على التوالي لكل منهما. بعد ذلك ، قم بتدوير المزرعة البكتيرية في القارورة ، ثم انقل كمية من البكتيريا إلى أنبوب معقم وقم بدوامة البكتيريا المؤشرة برفق ، ثم أضف 500 ميكرولتر من البكتيريا إلى كل أنبوب امتصاص. امزج عن طريق تحريك الأنابيب برفق. لا تقم أبدا بدوامة أو عينات العاثيات الماصة بقوة. احتضان خليط بكتيريا العاثيات عند درجة حرارة مناسبة لسلالة المؤشر لمدة 20 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، انقل أنبوبين ناعمين من أجار من حمام مائي 55 درجة مئوية إلى كتلة تسخين 48 درجة مئوية. توازن لمدة 10 دقائق. قم بتسمية لوحين من ألواح الأجار الصلبة الخالية من المغذيات المتوازنة مسبقا مع درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة أنبوب أجار ناعم من كتلة الحرارة وتأكد من أن المحتويات ليست ساخنة جدا بحيث لا يمكن لمسها. بعد ذلك ، انقل الخليط بشكل معقم من أنبوب امتصاص العاثيات إلى أنبوب الأجار الناعم. ثم قم بالتدوير بسرعة بين راحة اليد لخلط المحتويات. مع وجود الأنبوب بيد واحدة ، افتح غطاء لوحة الأجار الصلبة باليد الأخرى. صب محتويات الأنبوب بالكامل على الفور على سطح لوحة أجار صلبة. هز اللوحة بسرعة وبلطف. أغلق الغطاء وضع الطبق على مستوى لمدة 30 دقيقة حتى يتجمد الأجار الناعم. بعد ذلك ، كرر الإجراء الخاص بأنبوب امتصاص التحكم عن طريق نقل خليط التحكم إلى أنبوب أجار ناعم. خلطها ، وصب المحتويات على طبق أجار صلب ، وهزها ، والسماح للأجار الناعم بالتصلب لمدة 30 دقيقة. افحص الألواح بحثا عن تكوين البلاك. لعزل البلاك عن خليط غير متجانس ، قم بثقب المركز بعناية باستخدام عود أسنان معقم وانقل اللقاح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم يحتوي على 100 ميكرولتر من العاثية. استمر في تنقية هذا المحلل عن طريق تكرار مقايسة البلاك ثلاث إلى ست مرات مع التخفيفات التسلسلية حسب الضرورة. يستغل الطلاء المتماثل نمطا ظاهريا قابلا للتحديد من خلال السماح بمقارنة نمو الخلايا على لوحة أولية بألواح ثانوية. ضع علامة على شبكة في الجزء السفلي من اللوحة ، وقم بتسمية اللوحة الأساسية ، وترقيم المربعات الناتجة. الآن ، استخدم تقنية التعقيم لإزالة عود أسنان معقم مسبقا من الدورق ، وامسح منتصف كل مربع بعينة خلية ، وتخلص من عود الأسنان في وعاء نفايات مناسب. احتضان اللوحة الأولية. قم بتكديس اللوحة الأولية وجميع اللوحات الثانوية. ضع علامة اتجاه على جانب النصف السفلي من الألواح. الآن قم بإزالة قطعة قماش مخملية معقمة من غلافها وضعها على الكتلة الأسطوانية. بعد ذلك ، ضع الحامل الذي يقوم بمحاذاة العلامات الموجودة على الحامل مع تلك الموجودة على الكتلة. لاحظ علامة الاتجاه على الكتلة والحامل. بعد ذلك ، قم بإزالة الغطاء من اللوحة الأولية. محاذاة علامات الاتجاه على اللوحة والكتلة. اخفض اللوحة بحيث يتلامس سطح الأجار مع قطعة القماش المخملية. باستخدام أطراف الأصابع ، اضغط برفق ولكن بالتساوي على الجزء الخلفي من اللوحة الأساسية ثم ارفعها بعناية عن الكتلة. تأكد من أن بصمة الخلايا يمكن رؤيتها على المخمل. استبدل الغطاء على اللوحة. الآن ، كرر البروتوكول بالتتابع على قطعة القماش المخملية مع كل لوحة من اللوحات الثانوية. استخدم الانطباع المخملي للخلايا من اللوحة الأولية لتلقيح ما يصل إلى ثماني لوحات ثانوية مرتبة من الركيزة الأقل إلى الأكثر ملاءمة. أخيرا ، كعنصر تحكم إيجابي ، بالنسبة لللوحة الأخيرة في السلسلة ، استخدم وسط أجار حيث يجب أن تنمو جميع السلالات التي تم اختبارها. قم بلصق الألواح المقلوبة معا واحتضنها. افحص الألواح الثانوية بحثا عن النمو. قم بإيقاف تشغيل موقد بنسن ثم ضع جميع المستلزمات جانبا. ضع ملابس المختبر الملوثة والأواني الزجاجية والنفايات الخطرة في وعاء التخلص المناسب. نظف منطقة العمل بمطهر. أخيرا ، اغسل يديك جيدا بالصابون المطهر والماء الدافئ. Serratia Marcescens هو بروتيوباكتريا سالبة الجرام على شكل قضيب تنتج صبغة حمراء تسمى prodigiosin. توجد بشكل شائع تنمو في الحمامات وعلى ستائر الدش. في هذا المثال ، تولد تقنية الصفيحة الخطية مستعمرات مفردة في الربع الرابع. يستخدم هذا التحليل للبكتيريا الموجودة في عينة المياه التي تم جمعها من نافورة شرب عامة تقنية Pour Plate. لاحظ الاختلاف في مظهر المستعمرات. المستعمرات السطحية كبيرة ودائرية الشكل في حين أن بعض المستعمرات السطحية صغيرة جدا وغير منتظمة الشكل. تعد تقنية Spread Plate مكونا مهما في تجارب التخصيب والاختيار والغربلة. على سبيل المثال ، طريقة كوباكابانا هي أداة تمييز في الشاشة الكلاسيكية ذات اللون الأزرق والأبيض في تقنية الحمض النووي المؤتلف. العاثية T4 هي عاثية الحمض النووي الخبيثة مزدوجة الشريطة تصيب مضيفها مثل الإشريكية القولونية لتحلل وإطلاق العاثية النسلية. يظهر اختبار البلاك هذا على أجار EHA العاثية في مناطق المقاصة التي يبلغ قطرها حوالي ملليمتر واحد. في حالة عدم وجود جزيئات العاثيات المصابة ، ينتج عن نمو البكتيريا تعليق غائم للخلايا في الأجار الناعم حيث لا تظهر المستعمرات المنفصلة. في تقنية تراكب الأجار الناعم ، تختلف أشكال البلاك. على سبيل المثال ، هنا تنتج نفس سلالة مضيف المتفطرة موروفيولوجيا لوحة مميزة في وجود مدمرات العاثيات للبكتيريا الدقيقة مقابل عاثية البكتيريا الفطرية MSSS. تكمن قوة الطلاء المقلد في الفحص المتزامن لعدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة. في هذه الحالة ، تم اختبار أربع سلالات كاذبة مكررة للنمو على ثلاثة مصادر كربون مختلفة. الأسيتاميد, اللاكتوز, والجلايسين. هنا ، اللوحة الأولية عبارة عن وسط YTA كامل تم تلقيحه بالسلالات الأربع كما هو موضح. تظهر السلالات أنماط نمو متغيرة على ألواح متماثلة من الحد الأدنى من وسط MSA مكمل بمصدر واحد للكربون الأسيتاميد أو اللاكتوز أو الجلايسين. تنمو جميع السلالات على آخر لوحة تحكم إيجابية تؤكد نقل الخلايا إلى جميع الألواح الثانوية في هذه السلسلة. تفاصيل الجدولة لنتائج اللوحة المتماثلة هذه الفحص المتزامن لسلالات النوع البري المختلفة لمتطلبات النمو المميزة.

- بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ إجراءات الطلاء دون تلويث الوسائط أو الثقافات وأيضا استخدام طريقة الطلاء المناسبة لأي مهمة تجريبية معينة في المختبر. يتطلب إتقان هذه التقنيات ممارسة. ومع ذلك ، مع التدريب المناسب ، ستصبح إجراءات الطلاء الموضحة في هذا الفيديو طبيعة ثانية عند العمل على مقعد المختبر.