الكشف عن التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة باستخدام التصوير الفلوري

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقة أحادية للخلية الظهارية الملتصقة المعرضة للالتصاق بالبكتيريا.

أضف أعدادا متفاوتة من Pseudomonas aeruginosa الموسومة بالبروتين الفلوري ، وهي بكتيريا مسببة للأمراض ، لتحقيق نسبة البكتيريا إلى الخلايا الظهارية المرغوبة.

جهاز طرد مركزي لتقريب البكتيريا من الخلايا الظهارية ، مما يسهل التفاعلات.

تلعب الألياف البروتينية من النوع الرابع ، وهي ألياف بروتينية على البكتيريا ، دورا محوريا من خلال الارتباط بجليكوليبيدات معينة على الخلايا الظهارية ، مما يتوسط في التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة.

بعد الحضانة ، يغسل بمخزن مؤقت لإزالة البكتيريا غير الملتصقة. إصلاح الخلايا للحفاظ على بنية الخلية.

أضف DAPI ، وهي صبغة فلورية ترتبط بقوة بمناطق الحمض النووي الغنية ب AT ، مما يؤدي إلى تلطيخ النواة. قم بتغطية الخلايا بمحلول عازل لمنع جفاف الخلايا.

احصل على صور للبكتيريا المسماة GFP المرتبطة بالخلايا الظهارية ذات النواة الملطخة ب DAPI. تعداد البكتيريا الملتصقة على خلية ظهارية واحدة.

تتيح زيادة البكتيريا الملتصقة لكل خلية مضيفة بطريقة تعتمد على الجرعة القياس الكمي للتفاعلات بين المضيف والمسببات للمرض.

لفحص الالتصاق البكتيري، اغسل الطبقات الأحادية للخلية A549 المزروعة مسبقا ثلاث مرات عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PBS الدافئ إلى كل بئر، وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل. ثم تجاهل PBS. بدلا من ذلك ، بعد إضافة PBS ، انتظر لمدة عشر ثوان ثم قم بإزالة PBS باستخدام الفراغ.

لتحديد حركية الارتباط البكتيري ، قم بتراكب الخلايا ب 100 ميكرولتر من التركيزات المرغوبة من المعلق البكتيري مع تعدد مختلف من العدوى. قم بتدوير البكتيريا واحتضان خلايا A549 المصابة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إضافية. قم بإزالة البكتيريا غير المرتبطة عن طريق غسل الطبقات الأحادية خمس مرات باستخدام PBS دافئ كما هو موضح.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد في جميع آبار صفيحة 96 بئرا على الجليد. بعد 15 دقيقة ، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة محلول التثبيت ، وتلطيخ النوى ب 50 نانوجرام لكل مليلتر من صبغة DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، قم بتغطية خلايا A549 المصابة ب 100 ميكرولتر من PBS لتجنب الجفاف ، ثم قم بتخزين اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين في الظلام أو تابع التصوير.