تصور المقاومة البكتيرية باستخدام تحقيقات المضادات الحيوية الفلورية

المضادات الحيوية الموسومة بالفلورسنت هي أدوات قوية يمكن استخدامها لدراسة جوانب متعددة من مقاومة مضادات الميكروبات. تصف هذه المقالة إعداد المضادات الحيوية الموسومة بالفلورسنت وتطبيقها لدراسة مقاومة المضادات الحيوية في البكتيريا. يمكن استخدام المسابير لدراسة آليات المقاومة البكتيرية (على سبيل المثال، efflux) عن طريق قياس الطيف الضوئي، وقياس التدفق الخلوي، والمجهر.

يسمح إعداد المضادات الحيوية الفلورية بتقييم توطين هذه الكواشف العلاجية داخل البكتيريا من خلال تقنيات تحليلية مريحة مثل القياس الطيفي والمجهري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السهولة التي يمكن بها تحديد توطين المضادات الحيوية. هذا التعريب هو ذات الصلة لعدد من الظواهر بما في ذلك efflux.

لتنفيذ إجراء رد فعل انقر فوق، ضع مضاد حيوي azide من الفائدة في قارورة أسفل مستديرة وإضافة 25 ملليلتر من البيروتانول العالي و 25 ملليلتر من الماء لكل ملليمول من الأزيد إلى قارورة. إضافة الفلوروفور الكاين أعدت إلى المحلول وسخنا رد فعل إلى 50 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف 0.6 مكافئ من كبريتات النحاس و2.4 مكافئ من حمض الأسكوربيك إلى القارورة.

يحرك رد الفعل لمدة ساعة واحدة أو حتى تحليل من قبل LCMS يشير إلى الانتهاء من التفاعل. ثم تبريد وتنقية رد فعل حسب الاقتضاء للسقالة المضادات الحيوية. هنا، مفتاح مفتاح فوق التفاعل الكيميائي لإعداد المضادات الحيوية الفلورية مع أمثلة من هيكل توليفها من المضادات الحيوية المقابلة عبر وسيط أزيد على أساس سيبروفلوكساسين، linezolid، ويتم عرض تريميتهوبريم.

في هذه الآثار الطيفية الكتلة الكروماتوغرافية السائلة من أزيدي سيبروفلوكساسين ورد فعل انقر على الكينة الوطنية، تم استلثار azide في 3.2 دقيقة والمنتج كان مُلَح في 3.8 دقيقة. يمكن أن يتبع التقدم في رد فعل النقرة اختفاء قمة azide. في هذه الأطياف، يمكن تصور تأثير التطهير مع القمم الخاطئة تختفي.

لتقييم النشاط المضاد للميكروبات من المضادات الحيوية توليفها, مخزون الجلسرين سلسلة من السلالات البكتيرية المناسبة للسقالة المضادات الحيوية على لوحات LB agar وتنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، واختيار مستعمرة واحدة من كل لوحة والثقافة المستعمرات بين عشية وضحاها في خمسة ملليلتر من CAMHB لكل ثقافة في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تمييع الثقافات حوالي 40 مرة في CAMHB الطازجة وتنمو البكتيريا إلى منتصف مرحلة السجل مع كثافة بصرية في 600 نانومتر بين 0.4 و 0.8.

المقبل, إعداد حلول الأسهم من كل مضاد حيوي الفلورسنت في 1.28 ملليغرام لكل ملليلتر في 20٪ ثنائي الفينيل السلفيد في الماء المعقم وإضافة 10 ميكرولترات من المضادات الحيوية إلى كل بئر من العمود الأول من لوحة 96 جيدا. أضف 90 ميكرولترات من CAMHB إلى كل بئر من العمود الأول و50 ميكرولترات إلى جميع الآبار الأخرى. ثم قم بإجراء تخفيف متسلسل مزدوج عبر اللوحة.

بعد خلط دقيق، تمييع الثقافات مرحلة منتصف سجل إلى ما يقرب من مرة واحدة 10 إلى وحدة تشكيل مستعمرة السادسة لكل ملليلتر وإضافة 50 ميكرولترات من كل ثقافة إلى آبار التخفيف للحصول على تركيز النهائي من حوالي خمس مرات 10 إلى مستعمرة الخامسة تشكيل وحدات لكل ملليلتر. عندما تم مطلي جميع البكتيريا، ووضع الأغطية على لوحات واحتضان الثقافات لمدة 18 إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية دون اهتزاز. في اليوم التالي، فحص بصريا لوحات.

وسيكون الحد الأدنى من تركيز التثبيط هو أدنى مستوى تركيز جيد دون نمو واضح. لتحليل تراكم التحقيق, الأسهم الجلسرين سلسلة من السلالات البكتيرية على لوحات LB أجار لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، اختر مستعمرة واحدة من الصحن لثقافة بين عشية وضحاها في مرق الlysogeny في 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، تمييع ثقافة بين عشية وضحاها ما يقرب من 50 أضعاف في الوسط الطازج. عندما تصل الثقافة إلى منتصف مرحلة السجل ، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وdedeant المتوسطة. إعادة تعليق البكتيريا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي البكتيريا مرة أخرى.

Decant فائقة و resuspend بيليه غسلها في برنامج تلفزيوني إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر من اثنين. إضافة 10.1 ميكرولترات من 10 ملليمتر CCCP في برنامج تلفزيوني إلى ملليلتر واحد من البكتيريا واحتضان البكتيريا في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من 10 إلى 100 محلول المضادات الحيوية الفلورية الدقيقة في برنامج تلفزيوني.

بعد حضانة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي أربع مرات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة في غسل. بعد الغسيل ، تحلل البكتيريا مع 180 ميكرولترات من عازلة التحلل و 70 ميكرولترات من lysozyme. بعد 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، تجميد ذوبان البكتيريا ثلاث مرات في ناقص 78 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على التوالي.

بعد الجولة الأخيرة من التجميد ذوبان، سونيكات العينة لمدة 20 دقيقة تليها حضانة 30 دقيقة في 65 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، وجمع العينة lysed عن طريق الطرد المركزي والضغط على محتويات الأنبوب من خلال غشاء مرشح 10 كيلودالتون. غسل المرشح أربع مرات مع 100 ميكرولترات من الماء لكل غسل و aliquot كل غسل في آبار فردية من أسفل مسطحة سوداء 96 جيدا لوحة.

ثم قياس كثافة الفلوريسين على قارئ لوحة مع الإثارة والطول الموجي الانبعاثات المناسبة لفلوروفور. هذه النتائج النموذجية من تقييم تراكم داخل الخلايا عن طريق التحليل الطيفي الفلوري في وجود وعدم وجود ايفلاكس تبين أن الفلورية داخل الخلايا من البكتيريا أعلى بكثير بعد المعالجة المسبقة مع CCCP مما يدل على أن efflux يقلل من تراكم داخل البكتيريا. في هذه الصور المجهرية confocal تمثيلية من البكتيريا السلبية الغرام إيجابية غرام، توطين المضادات الحيوية داخل البكتيريا يمكن تصور بعد العلاج CCCP.

ولا يلاحظ وجود هذه الظاهرة عند إضافة أي من الـ CCCP. عند استخدام المضادات الحيوية الفلورية، يجب مراعاة المعلومات التي تهدف إلى جمعها وتأكد من مراعاة البروتوكول الذي سيكون أكثر فائدة عند الحصول على هذه البيانات. بعد توليفها، يمكن استخدام المضادات الحيوية الفلورية لدراسة عدد من العمليات البكتيرية بما في ذلك التفاعلات هدف المخدرات وتعديلات المقاومة.