التحليل القائم على قياس التدفق الخلوي لتنشيط الخلايا المتغصنة باستخدام المجمعات المناعية

ابدأ بتعليق الخلايا السرطانية المثبت كيميائيا.

أضف تركيزا مثاليا للغلوبولين المناعي G المرتبط بالورم والذي يرتبط بمستضدات سطح الخلية السرطانية ، ويشكل مجمعات مناعية أو ICs.

انقل الدوائر المتكاملة إلى لوحة مزرعة تحتوي على خلايا متغصنة ملتصقة. حضن.

تتعرف الخلية المتغصنة على IC ، وتستوعبها ، وتعالجها إلى شظايا الببتيد.

يتم تحميل الشظايا على جزيئات معقدة التوافق النسيجي الرئيسية من الفئة الثانية أو معقد التوافق النسيجي الثاني ويتم تقديمها على سطح الخلية ، جنبا إلى جنب مع جزيء التكلفة CD86.

إزالة الوسائط. أضف حاجزا مؤقتا لتفكك الخلايا وماصة بقوة لفصل الخلايا.

نقل الخلايا إلى أنبوب.

جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في محلول حجب لمنع التفاعلات غير المحددة.

تراكب مع كوكتيل الأجسام المضادة المسمى بالفلوروفور الذي يستهدف معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني و CD86.

أضف صبغة ملزمة للحمض النووي واحتضانها لفترة وجيزة لتلطيخ نوى الخلايا الميتة.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد الخلايا الحية التي تعبر عن معقد التوافق النسيجي الكبير - II و CD86 ، مما يؤكد تنشيط الخلايا المتغصنة بوساطة IC.

أولا ، قم بإصلاح الخلايا في 1.8٪ بارافورمالدهيد مخزن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بزرع معلق الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئرا على شكل حرف U. بعد ذلك ، أضف تخفيفات مختلفة من الأجسام المضادة المرتبطة بالورم في كل بئر. بعد ذلك ، احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 400 مرة جم لمدة 5 إلى 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، طرد المادة الطافية وغسل الخلايا مرتين. قم بإذابة الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروفور. بعد ذلك ، احتضن الطبق على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

بعد 15 إلى 20 دقيقة ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت لغسل الخلايا. الطرد المركزي للوحة على 400 مرة جم لمدة 5 إلى 10 دقائق. صب المادة الطاففة. إجراء قياس التدفق الخلوي لتحليل ارتباط الورم ، وتحديد الحد الأدنى من تركيز الغلوبولين المناعي G المطلوب لتغطية الخلايا.

بمجرد أن يتم طلاء الخلايا بالحد الأدنى من تركيز الغلوبولين المناعي G ، أضف المركب المناعي للورم المسمى CFSE إلى الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة بنسبة 1: 5. ثم احتضن الخليط لمدة 12 إلى 16 ساعة طوال الليل في وسط كامل. إجراء تحليل FACS لتنشيط الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلية الأحادية.