مقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا لقياس النشاط السام للخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النشاط السام للخلايا لخلايا T CD8 المتخصصة بمستضد معين باستخدام مقايسة التدفق الخلوي القائمة على الخلايا. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توسيع خلايا T CD8 المؤثرة لمدة ستة أيام في وجود الببتيد المطلوب، وفي الخطوة الثانية يتم تحميل خلايا T CD4 المستهدفة بالببتيد المطلوب ثم خلطها مع خلايا T CD4 غير المحملة. بعد ذلك، يتم استزراع خلايا T CD8 المؤثرة وخلايا T CD4 المستهدفة معاً لمدة ست ساعات بنسب مختلفة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة.

في الخطوة النهائية، يتم قياس كمية الخلايا التائية CD4 المستهدفة والمحملة بالببتيدات والتي تم قتلها، وعدد الخلايا التائية CD8 المؤثرة باستخدام قياس التدفق الخلوي. وفي النهاية، يمكن حساب قدرة القتل الجوهرية للخلايا التائية CD8 النوعية للمستضد، والتي يتم التعبير عنها بوحدات تحللية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بمقايسة تحرر الكروموفور، في أن هذه التقنية تستخدم خلايا مستهدفة أولية ذاتية بدلاً من الخطوط الخلوية الخالدة والخلايا المستهدفة الفعلية.

وذلك لأن أعداد الخلايا المؤثرة قابلة للقياس على مستوى الخلية الواحدة. الآن، سيقوم مساعد البحث في مختبري بشرح إجراء عزل الخلايا المؤثرة الموجبة لـ CD8. ابدأ بإذابة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) ذاتياً والمحفوظة بالتجميد في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، ثم اغسل الخلايا في ما يصل إلى 50 mL من الوسط الغذائي الكامل.

بعد العد، قم بتخفيف الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) بتركيز 5 million cells per milliliter في وسط غذائي كامل، ثم أضف IL-2 والببتيد المطلوب إلى المزرعة. بعد ذلك، وزع 1 mL من معلق الخلايا في كل بئر من طبق يحتوي على 96 بئراً. وبعد ثلاثة أيام من الزرع، استبدل نصف السائل الطافي بوسط غذائي كامل جديد. وبعد ستة أيام من الزرع، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل الخلايا إلى خزان معقم، ثم قم بعد الخلايا وغسلها.

أعد تعليق الراسب بكثافة 50 مليون خلية لكل ملليلتر في محلول منظم للفصل، ثم قم بتحضين خلايا pbmc في أنبوب ذو قاع مستدير سعة 14 ملليلتر مع مزيج إثراء الخلايا التائية البشرية CD8 الموجبة بتركيز 50 ميكرولتر لكل ملليلتر من الخلايا في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق، قم بتحضين الخلايا مع جسيمات مغناطيسية مقترنة بـ anti CD8 IgG بتركيز 150 ميكرولتر لكل ملليلتر لمدة خمس دقائق إضافية، ثم أكمل حجم معلق الخلايا إلى سبعة ملليلتر باستخدام محلول منظم للفصل إضافي. ضع الأنبوب في المغناطيس الفاصل، وبعد خمس دقائق بينما لا يزال الأنبوب في المغناطيس، صب الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. بعد ذلك، قم بصبغ عينة صغيرة من الخلايا باستخدام أجسام مضادة ضد CD3 و CD8 في محلول PBS مضاف إليه 2%FBS لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

تأكد من أن نقاء الخلايا هو 95% CD8 positive أو أعلى باستخدام قياس التدفق الخلوي. الآن أضف 225 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى خمسة أنابيب ذات أغطية لولبية، ثم قم بتخفيف الخلايا تسلسلياً من 1:2 إلى 1:32. لعزل الخلايا المستهدفة CD4 positive، ابدأ بإذابة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيط (pbmc) ذاتية المنشأ والمجمدة مسبقاً في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C.

انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 10 milliliters من الوسط الغذائي. قم بإثراء الخلايا التائية التي تعبر عن CD4 عن طريق الفصل بالجسيمات المغناطيسية كما تم توضيحه للتو، مع التأكد من أن نقاوة الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 تبلغ 95% أو أكثر باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد عد الخلايا، قسمها إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 milliliter، ثم اغسلها باستخدام PBS دافئ، وأعد تعليق الرواسب بتركيز 20 million cells per milliliter في PBS.

بعد التأكد من حماية الخلايا من الضوء، يتم صبغ نصف خلايا T الموجبة لـ CD4 باستخدام محلول CFSE عالي التركيز والمحضّر حديثاً للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.2 millimolar، والنصف الآخر باستخدام محلول CFSE منخفض التركيز والمحضّر حديثاً للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.04 millimolar، وذلك لمدة 15 دقيقة عند 37 °C في 5% CO2. وفي نهاية فترة الصبغ، يتم تدوير الخلايا ميكانيكياً ثم إعادة تعليق الرواسب في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل الدافئ لإيقاف تفاعل الوسم. بعد ذلك، يتم تحفيز خلايا T الموجبة لـ CD4 المصبوغة بتركيز CFSE منخفض باستخدام التركيز النهائي 5 µg/mL من الببتيد المستهدف في الوسط الغذائي الكامل لمدة 45 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد فترة الحضانة، اغسل كلا المجموعتين من الخلايا التائية ذات المستويات العالية والمنخفضة من CFSE. ثم أعد تعليق كلا المعلقين الخلويين في وسط غذائي غير مكتمل بحيث يكون التركيز 200,000 خلية لكل ملليلتر من الوسط غير المكتمل، وبعد ذلك اخلط المجموعتين المستهدفتين بنسبة واحد إلى واحد من الخلايا ذات المستوى العالي من CFSE إلى الخلايا ذات المستوى المنخفض من CFSE.

أضف الآن 100 µL من الخلايا التائية المستهدفة المختلطة والموجبة لـ CD4 إلى كل بئر في طبق 96 بئر بقاع مستدير، ثم ازرع 1 µL من كل معلق للخلايا التائية الموجبة لـ CD8 في مكررات، ليصل الحجم النهائي إلى 200 µL لكل بئر. قم بقياس موت الخلايا المبرمج الأساسي عبر زراعة ثلاثة آبار بخلايا مستهدفة فقط، ثم حضن المزرعة المشتركة لمدة ست ساعات في حاضنة زراعة الخلايا. بعد اكتمال فترة التحضين، انقل الخلايا إلى طبق VBO 96 بئر وقم بصبغ كل بئر باستخدام رباعيات MHC الببتيدية المقترنة بـ PE لمدة 15 دقيقة.

في حضانة زراعة الخلايا، اغسل الخلايا بمحلول PBS المكمل بـ 2% FBS، ثم صبغ الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، مع حمايتها من الضوء بعد غسل الخلايا. مرة أخرى، أعد تعليق الكرات الخلوية (pellets) في 100 µL من الفورمالديتيد بتركيز 2% في محلول PBS، ثم حلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry). بعد الزراعة المشتركة، يتم تحليل الخلايا وتحديد بواباتها (gating) كما هو موضح في هذه المخططات النقطية.

يتم تحليل نسبة الخلايا المستهدفة الحية ذات التعبير العالي عن CFSE مقابل تلك ذات التعبير المنخفض عن CFSE، سواء كانت غير محفزة أو محفزة بالببتيد، من خلال بوابة صغيرة للتشتت الأمامي والجانبي (forward by side Scatter GA). يتم تحديد الخلايا الحية بناءً على كونها سالبة لصبغة الحيوية (live dead negative)، ثم تُرسم الخلايا التائية CD4 الموجبة وفقاً لـ CFSE لتحليل نسبة الخلايا ذات التعبير المنخفض عن CFSE مقابل الخلايا ذات التعبير العالي عن CFSE. بعد ذلك، يتم إنشاء بوابة أكبر للتشتت الأمامي والجانبي لحصر العدد الإجمالي للخلايا المؤثرة والمستهدفة، سواء كانت ميتة أو حية. وبعد فترة حضانة مدتها ست ساعات، تُرسم الخلايا التائية CD8 الموجبة و tetramer الموجبة، والخلايا التائية CD4 الموجبة ذات التعبير المنخفض عن CFSE، لتحليل نسبة الخلايا المؤثرة مقابل الخلايا المستهدفة.

يتم بعد ذلك تحديد العدد الإجمالي للخلايا التائية المؤثرة الموجبة لـ CD8 من خلال تحديد الخلايا الموجبة لـ CD8 والموجبة للتيترا مير (tetramer). ويتم تحديد العدد الإجمالي للخلايا المستهدفة من خلال تحديد الخلايا التائية الموجبة لـ CD4، والمنخفضة في CFSE، والخلايا الحية والميتة الموجبة والسالبة. وتكون نسبة الهدف للخلايا منخفضة CFSE مقابل الخلايا عالية CFSE هي واحد إلى واحد.

عندما تُزرع الخلايا المستهدفة الإيجابية لـ CD four في غياب الخلايا المؤثرة، تنخفض هذه النسبة بشكل حاد. وعندما يتم تحضين الخلايا ذات النبضة الإيجابية المنخفضة لـ CFSE مع مجتمع خلايا T الإيجابية لـ CD eight الكلي الذي يحتوي على خلايا T المؤثرة الإيجابية لـ CD eight النوعية للمستضد.

مع انخفاض النسبة، تبدأ الخلايا المستهدفة المحفزة بالببتيد والموجبة لـ CD4 والمنخفضة في CFSE في التحول إلى موجبة لصبغة live/dead. ويؤدي تخفيف الخلايا المؤثرة بالتالي إلى استعادة نسبة CFSE، وفي النهاية استعادة عدد الخلايا التائية المستهدفة الحية والموجبة لـ CD4 والمنخفضة في CFSE والمحفزة بالببتيد. يمكن بعد ذلك رسم النسبة المئوية للتحلل النوعي كدالة في نسبة الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة على مقياس لوغاريتمي. وكما هو موضح في الرسم البياني، يتم حساب الانحدار الخطي من المخطط، وتُستخدم معادلة خط الاتجاه لحساب الوحدات التحليلية.

هذا هو عدد الخلايا التائية المؤثرة الموجبة لـ CD8 المطلوبة لقتل 30% من مليون خلية تائية مستهدفة موجبة لـ CD4، وذلك لتحديد القدرة التحللية الذاتية للخلايا التائية الموجبة لـ CD8 النوعية للمستضد، ولمقارنة النتائج بين المتبرعين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام قياس التدفق الخلوي لقياس النشاط السام للخلايا التائية CD النوعية للمستضد. يمكن أيضاً تطبيق هذه التقنية بسهولة على نوع الخلايا F الخاص بك.