مقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا لقياس النشاط السام للخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النشاط السام للخلايا لثماني خلايا تائية CD الخاصة بالمستضد باستخدام مقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلية. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق توسيع المؤثرات المضغوطة ثماني خلايا تائية لمدة ستة أيام في وجود الببتيد محل الاهتمام في الخطوة الثانية المستهدفة CD أربع خلايا تائية هي نبضات مع الببتيد محل الاهتمام ثم مختلطة مع قرص مضغوط غير منشور أربع خلايا TT. بعد ذلك ، يتم زراعة المستجيب القرص المضغوط ثماني خلايا تائية وأربع خلايا تائية مستهدفة لمدة ست ساعات بنسب مستجيب مختلفة إلى مستهدف.

في الخطوة الأخيرة ، يتم قياس قتل القرص المضغوط المستهدف المحمل بالببتيد وأربع خلايا تائية وعدد الخلايا التائية المستجيبة عن طريق قياس التدفق الخلوي. في النهاية ، يمكن حساب قدرة القتل الجوهرية لخلايا CD الثماني التائية الخاصة بالمستضد المعبر عنها في وحدات الحالة اللايتية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية للمادة الأكسجين مثل مقايسة إطلاق aro ، في أن هذه التقنية تستخدم الخلايا المستهدفة الأولية الذاتية بدلا من خطوط الخلايا الخالدة والخلية المستهدفة الفعلية.

يمكن قياس عدد خلايا هذا والمستجيب على مستوى الخلية الواحدة. في وقت مبكر الآن ، سيوضح مساعد باحث في مختبري الإجراء لعزل الخلايا المستجيبة الثمانية للقرص المضغوط. ابدأ بإذابة pbmc المحفوظ بالتبريد الذاتي في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم اغسل الخلايا في ما يصل إلى 50 مل من الوسائط الكاملة.

بعد العد ، قم بتخفيف pbmc بتركيز 5 ملايين خلية لكل مليلتر في وسائط كاملة ثم أضف IL اثنين والببتيد الذي يهم الثقافة. البذرة التالية ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل بئر من 96 لوحة بئر. بعد ثلاثة أيام من الاستزراع، استبدل نصف المادة الطافية بوسائط كاملة جديدة بعد ستة أيام من الاستزراع، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل الخلايا إلى خزان معقم ثم عد الخلايا وغسلها.

أعد تعليق الحبيبات عند 50 مليون خلية لكل مليلتر في مخزن مؤقت للفصل واحتضان pbmc في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مليلتر مع كوكتيل تخصيب الخلايا التائية الإيجابية المضغوطة البشرية بمعدل 50 ميكرولتر لكل مليلتر خلية في درجة حرارة الغرفة بعد 10 دقائق ، احتضان الخلايا بجزيئات مغناطيسية مترافقة مضادة للقرص المضغوط ثمانية IgG عند 150 ميكرولتر لكل مليلتر لمدة خمس دقائق أخرى ، ثم قم بإحضار تعليق الخلية حتى سبعة ملليلتر مع عازلة فصل إضافية. ضع الأنبوب في مغناطيس الفصل بعد خمس دقائق مع بقاء الأنبوب في المغناطيس ، اسكب الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، قم بصبغة صغيرة من الخلايا بالأجسام المضادة ضد القرص المضغوط الثالث والقرص المضغوط ثمانية في PBS مكملة ب 2٪ FBS لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

تأكد من أن نقاء الخلايا هو 95٪ CD ثمانية إيجابي أو أعلى عن طريق قياس التدفق الخلوي. أضف الآن 225 ميكرولترا من الوسائط الكاملة إلى خمسة أنابيب ذات غطاء لولبي ، ثم قم بتخفيف الخلايا بشكل متسلسل من واحد إلى اثنين إلى واحد إلى 32. لعزل القرص المضغوط ، تبدأ أربع خلايا مستهدفة إيجابية بإذابة pbmc المحفوظ بالتبريد الذاتي في حمام مائي 37 درجة مئوية.

انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من الوسائط. إثراء للقرص المضغوط أربعة تعبر عن الخلايا التائية عن طريق فصل الجسيمات المغناطيسية كما هو موضح للتو يؤكد نقاء 95٪ أو أعلى من الخلايا التائية المضغوط الأربعة موجبة عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد عد الخلايا ، قم بتقسيمها إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 مليلتر ثم اغسلهما في PBS دافئ ، وأعد تعليق الكريات عند 20 مليون خلية لكل مليلتر في PBS.

بعد التأكد من حماية الخلايا من البقع الخفيفة ، قم بعمل نصف الخلايا التائية المضغوطة الأربع موجبة مع محلول عمل عالي CFSE معد حديثا إلى تركيز نهائي يبلغ 0.2 ملليمولار والنصف الآخر في محلول عمل منخفض CFSE معد حديثا إلى تركيز نهائي يبلغ 0.04 ملليمولار لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية فترة التلوين ، قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من الوسائط الكاملة الدافئة لإخماد تفاعل وضع العلامات. نبض الخلايا التائية المنخفضة CFSC منخفضة القرص المضغوط بتركيز نهائي قدره خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من الببتيد محل الاهتمام في الوسائط الكاملة لمدة 45 دقيقة في حاضنة زراعة الخلية.

بعد الحضانة ، اغسل كل من الخلايا التائية المرتفعة والمنخفضة CFSC. مرتين الوسائط غير المكتملة وإعادة التركيب تعليق كل من تعليق الخلية في 200,000 الخلايا في المليلتر. كل وسائط غير مكتملة ، ثم تخلط المجموعتين المستهدفتين بنسبة CFSE عالية إلى CFSE منخفضة من واحد إلى واحد.

أضف الآن 100 ميكرولتر من القرص المضغوط المستهدف المختلط ، وأربع خلايا تائية موجبة إلى كل بئر في صفيحة بئر 96 قاعية مستديرة ، ثم قم بزرع ميكرولتر واحد من كل قرص مضغوط ، وثمانية معلقات إيجابية للخلايا التائية في نسختين للحصول على حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر. قم بقياس بذور موت الخلايا المبرمج القاعدي بثلاثة آبار بالخلايا المستهدفة وحدها ، ثم احتضان الزراعة المشتركة لمدة ست ساعات في حاضنة زراعة الخلايا. بعد اكتمال الحضانة ، انقل الخلايا إلى لوحة VBO 96 Well وصمة عار كل بئر باستخدام Tetramers الببتيد المترافق PE MHC لمدة 15 دقيقة.

في حاضنة زراعة الخلايا ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المكمل بنسبة 2٪ FBS ثم قم بتلطيخ الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء بعد غسل الخلايا. مرة أخرى ، أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من 2٪ من الفورمالديهايد في PBS وتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد الزراعة المشتركة ، يتم تحليل الخلايا وتغطيتها كما هو موضح في هذه المخططات النقطية.

المنخفضة CFSE القابلة للحياة مقابل الخلايا المستهدفة المنخفضة CFSE ، غير المنشورة أو الببتيد النبضية من خلايا حية صغيرة إلى الأمام جنبا إلى جنب يتم بوابات الخلايا الحية GA المبسورة على سلبية حية ميتة ويتم رسم أربع خلايا تائية موجبة على CFSE لتحليل نسبة الخلايا المنخفضة CFSE مقابل الخلايا المرتفعة CFSE. بعد ذلك ، يتم إنشاء بوابة مبعثرة أكبر للأمام لتعداد العدد الإجمالي للمستجيب الميت أو الحي والخلايا المستهدفة. بعد حضانة القرص المضغوط لمدة ست ساعات ، ثماني خلايا تائية إيجابية ، رباعي إيجابية و CFSE ، يتم رسم أربع خلايا تائية موجبة منخفضة لتحليل نسبة المستجيب مقابل الخلايا المستهدفة.

يتم تحديد العدد الإجمالي للمستجيب CD ثماني خلايا تائية موجبة عن طريق البوابات على القرص المضغوط ثماني خلايا موجبة رباعي موجبة يتم تحديد العدد الإجمالي للخلايا المستهدفة عن طريق البوابات على قرص نزع السلاح أربع خلايا تائية موجبة ، CFSE ، خلايا موجبة وسالبة منخفضة وميتة حية. النسبة المستهدفة من CFSE منخفضة مقابل الخلايا المرتفعة CFSE هي واحد إلى واحد.

عندما يتم زراعة الخلايا المستهدفة الأربعة الإيجابية للقرص المضغوط في غياب الخلايا المستجيبة ، تنخفض هذه النسبة بشكل كبير. عندما يتم تحضين خلايا النبض الإيجابية المنخفضة CFSE. مع إجمالي القرص المضغوط ثمانية إيجابية من الخلايا التائية تحتوي على مستضد محدد CD ثمانية خلايا تائية مستجيبة إيجابية.

مع انخفاض النسبة ، تبدأ الخلايا المستهدفة النبضية المنخفضة CFSE ، وأربعة خلايا مستهدفة نبضية موجبة ، في أن تصبح حية ميتة ، وتخفيف الخلايا المستجيبة ، مما يؤدي إلى استعادة نسبة CFSE وفي النهاية استعادة عدد نبضات الببتيد القابلة للحياة ، CFSE ، القرص المضغوط المنخفض ، أربعة خلايا تائية مستهدفة إيجابية. يمكن بعد ذلك رسم النسبة المئوية للتحلل المحدد كدالة لنسبة المستجيب إلى الهدف في مقياس لوغاريتمي. كما هو موضح في الرسم البياني ، يتم حساب الانحدار الخطي من المؤامرة ويتم استخدام معادلة خط الاتجاه لحساب الوحدات اللايتي.

هذا هو عدد الخلايا التائية المستجيبة المضغوطة الثمانية المطلوبة لقتل 30٪ من 1 مليون CD مستهدف أربع خلايا تائية موجبة لتحديد القدرة الجوهرية للخلايا المضغوطة الثماني خلايا التائية الإيجابية الخاصة بالمستضد ، ومقارنة النتائج بين المتبرعين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام القياس الخلوي لقياس نشاط التأكسجين لخلايا CD T الخاصة بالمستضد. يمكن أيضا اعتماد هذه التقنية بسهولة لنوع الخلايا F الخاصة بك.