طريقة قائمة على التألق المناعي لقياس إجهاد النسخ المتماثل في الخلايا السرطانية

ابدأ بالخلايا السرطانية التي تحمل IdU ، وهو بديل اصطناعي لنيوكليوتيد الثايميدين ، مدمج بالفعل في حمضها النووي. عندما تواجه هذه الخلايا إجهاد النسخ المتماثل ، يتوقف تخليق الحمض النووي الخاص بها ، ويكشف عن IdU داخل مناطق الحمض النووي المكشوفة أحادية الشريطة.

قم بإصلاح الخلايا وإضافة جزيئات المنظفات لجعل غشاء الخلية قابلا للنفاذ.

أضف BSA لمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المستهدفة.

أدخل الأجسام المضادة ل IdU التي تتفاعل مع الحمض النووي أحادي الشريطة المسمى IdU.

أضف الأجسام المضادة الثانوية الخضراء المسماة بالفلوروفور والتي تستهدف الأجسام المضادة المضادة ل IdU. قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

ضع الغطاء على شريحة تحتوي على وسط تثبيت بصبغة فلورية — تلطخ النوى.

تحت المجهر الفلوري ، راقب النوى الزرقاء.

تمثل بؤر التألق الخضراء أجساما مضادة مرتبطة بالحمض النووي أحادي الشريطة.

احسب عدد البؤر لتحديد مستوى إجهاد النسخ المتماثل.

أضف 1 مليلتر من تعليق الخلية على أغطية بولي إل ليسين الموضوعة في آبار صفيحة 24 بئرا ، وقم بزراعة الخلايا في وسط الثقافة في ظل الظروف القياسية. بعد مضاعفة مجموعة واحدة ، استنشق الوسائط الموجودة من اللوحة ونبض الخلايا ب 10 ميكرومولار IdU لمضاعفة السكان اللاحقة.

لحصاد الخلايا ، استبدل الوسط بمثلج بارد 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة 5 دقائق. لتثبيت الخلايا ، قم بشفط PBS