سير العمل عالية المحتوى، الكمي خلية فردية من نيون علامات من المجاهر البيانات العالمي، بدعم من برمجيات المصدر المفتوح

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس استجابات الخلايا الفردية بشكل موضوعي عن طريق تحديد كثافة علامات الفلورسنت المحددة من صور المجهر. يتم تحقيق ذلك عن طريق إخضاع خلايا زراعة الأنسجة الملتصقة أولا للضربة القاضية الجينية بوساطة irna. في الخطوة الثانية ، يتم تلطيخ الخلايا بالفلورسنت ثم تصويرها لعدة علامات ذات أهمية.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تحديد التعبير عن العلامات داخل مناطق فرعية محددة خوارزميا ، وهي خلايا فردية. في النهاية ، يمكن تحليل الاستجابات الخلوية للإشارات البيولوجية من الضربة القاضية للجينات عن طريق قياس مستويات التعبير الفلوري لعلامات الاهتمام وانتقالها تحت الخلية. على الرغم من أن هذا الإجراء يوفر نظرة ثاقبة لتنظيم G ، إلا أن عبور دورة خلية واحدة استجابة ل siRNAs.

يمكن تطبيقه أيضا على الدراسات التي تولد صورا للخلايا الفلورية ، ودراسة النقل النووي وتوازن البروتين. سيثبت الإجراء دانيال ويك وكار ك هو زملائهما في باحثي ما بعد الدكتوراه من مختبري ابدأ بتوزيع 70 ميكرولتر من 200 نانومولار إيرنا ، مخفف من عازلة إيرنا في الآبار المناسبة للوحة بئر معقمة 96 في غطاء مزرعة أنسجة معقمة. ثم أضف 105 ميكرولتر من الدهون المرنة المخففة في 40 مجلدا من وسط DMEM الخالي من المصل في كل بئر سيدي ، واخلط اللوحة عن طريق الاهتزاز اللطيف لدرجة حرارة الغرفة ، ثم بعد 10 دقائق ، قم بتقسيم 175 ميكرولتر الناتجة إلى ثلاثة مكررات سعة 50 ميكرولتر لكل هدف في ثقافة أنسجة غير شفافة معالجة 96 لوحة بئر بقاعدة شفافة.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 8،000 خلية لكل بئر في 150 ميكرولتر من DMEM مع مصل 10٪ مباشرة على مجمعات IRNA الدهنية سعة 50 ميكرولتر دون خلط. ثم أغلق اللوحة بغشاء لاصق معقم قابل للتنفس وضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 48 ساعة ، استنشق الوسائط من اللوحات.

ثم قم بإصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر من الفورمالديهايد العازل بنسبة 4٪ في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة بعد 10 دقائق ، قم بشفط المثبت وقم بإجراء ثلاث غسلات سعة 100 ميكرولتر باستخدام PBS بعد الغسيل الأخير. قم بإزالة PBS وثقب الخلايا بثلاث دورات من حضانات محلول التجذر 100 ميكرولتر لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز. بعد الحضانة الأخيرة ، قم بإزالة محلول النفاذية ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الكتلة لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بشفط محلول الكتلة واستكشاف الخلايا ب 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية في غضون أسبوعين من وضع العلامات على المجهر متحد البؤر uc بهدف 20 × لالتقاط صور TIFF منفصلة بمقياس رمادي 16 بت في ثلاث قنوات تتوافق مع صبغة الحمض النووي GFP والتلوين المناعي. تلتقط نباتات الأربعة العديد من مجموعات الصور أو الإطارات غير المتداخلة لتصوير ما يقرب من 1000 إلى 2000 خلية لكل بئر. تسمية ملف الصورة بشكل منهجي باستخدام معلومات البيانات الوصفية بحيث يكون كل اسم ملف عبارة عن مجموعة فريدة من اسم التجربة وعنوان البئر ورقم الإطار ومعرف القناة.

ثم افتح برنامج ملف ملفات تعريف الخلية وانقر فوق ملف واستيراد خط الأنابيب. بعد ذلك ، ضمن من ملف ، حدد ملف أنبوب CP لخط أنابيب خط أنابيب ثلاث قنوات ، والذي يحتوي على الإرشادات اللازمة للبرنامج لتفسير البيانات الوصفية لملف الصورة من اسم الملف المحفوظ يمكن الآن استخدام ملف تعريف الخلية Convention لربط الصور ، واستخراج الحمض النووي النووي وشدة الأجسام المضادة من الملفات ، واستخدام قناة GFP لحساب نسبة كثافة السيتوبلازم النووي مقابل السيتوبلازم. لكل خلية تم اكتشافها، انقر فوق الزر عرض إعدادات الإخراج ثم انقر فوق مجلدات الإدخال الافتراضية والإخراج الافتراضي.

تحديد موقع ملفات الصور للتحليل والوجهة للبيانات المستخرجة على التوالي. ثم في نافذة وحدات التحليل ، انقر فوق أيقونات العين المناسبة لمراقبة تحديد الكائنات الأساسية ونوافذ الكائنات الثلاثية أثناء التحليل وانقر فوق تحليل الصور عند اكتمال التحليل. انقر فوق موافق في مربع الرسالة وانتقل إلى مجلد الإخراج الافتراضي الموقع حيث يتم حفظ جميع ملفات البيانات كملفات قيمة مفصولة بفواصل.

لإجراء استخراج البيانات ، ابحث عن ملف CSV الجديد للنوى المضمن ضمن الإخراج من ملف تعريف الخلية ، والذي يحتوي على بيانات الخلية الفردية لكثافة الأجسام المضادة النووية الفلورية كثافة الحمض النووي النووي و GFP CDK قيمتان لنسبة المراسل. انسخ ملف البرنامج النصي للنبض المقدم إلى مصنف المشي PL في نفس المجلد مثل ملف بيانات CSV النواة. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة لؤلؤة النصية.

وعندما يطلب منك ذلك ، اكتب الاسم الكامل لملف البيانات متبوعا باسم ملف DOT CSV للملف الذي سيتم فيه تسور الخلايا وقيم البوابة لمضان الجسم المضاد وبيانات المراسل G FP CDK اثنتين. تأكد من أن الملف الذي تم إنشاؤه حديثا يجمع بين قيم فحص الخلية الفردية الأولية من ملف تعريف الخلية الأصلي للبيانات مع تسميات السكان الفرعيين التي توضح كيفية أداء كل خلية من كل بئر مقابل كلتا البوابات. افتح الآن برنامج R Studio لرسم البيانات لكل حالة تجريبية باستخدام تسميات السكان الفرعيين للخلية الفردية بالنقر فوق الملف وفتح الملف ، ثم تحديد ملف نقطة التحليل المقدم.

اكتب عنوان الكمبيوتر الخاص بالمجلد الذي يحتوي على البيانات المسورة، بما في ذلك حرف محرك الأقراص واسم الملف نفسه. ثم قم بتمييز الأسطر من الأول إلى 17 في النافذة العلوية اليسرى من الاستوديو الخاص بنا ، وانقر فوق زر التشغيل لإدخال قيم عتبة البيانات التجريبية وتفاصيل موقع البئر. أخيرا ، قم بتمييز الكتل الفردية للتعليمات البرمجية المتبقية أسفل السطر 17 ، وانقر فوق الزر تشغيل لإنشاء المخططات المقابلة.

راقب المخططات في النافذة في الزاوية اليمنى السفلية من الاستوديو الخاص بنا ، ثم انقر فوق الزر تصدير لحفظها في مجموعة متنوعة من التنسيقات. يحلل سير العمل الموصوف هنا صور المجهر الفلوري لإنتاج بيانات أولية في شكل قائمة توضح بالتفصيل كل خلية محددة وقيم الفحص المقابلة لها. توجد العديد من الخيارات لتحليل هذه البيانات.

على سبيل المثال ، في مخططات الرسم البياني هذه ، تتيح قيم الفحص للخلايا المعالجة بالحمض النووي الريبي للتحكم تحديد البوابات المناسبة لعتبة كل فحص. ثم يتم تطبيق عتبات البوابات باستخدام برنامج نصي للنبض لتسمية كل خلية في البيانات الأولية وفقا لنتيجة الفحص. يساعد نهج وضع العلامات هذا في التقييم المرئي الأولي والآلي للعلاقات بين العلاجات والتوزيع الفرعي للمجموعات الكبيرة جدا من بيانات الخلايا الفردية.

على سبيل المثال ، في هذه التجربة التمثيلية ، أدت ظروف الضربة القاضية الثلاثية إلى توزيعات متناقضة للخلايا بالنسبة للبوابات هي المقايسان. تستخدم المخططات R التسميات لحساب التوزيعات المئوية للخلايا في كل ربع. تتيح الملصقات أيضا الرجوع إلى قياسات الفلورسنت الإضافية مع بيانات الفحص.

في هذه التجربة ، تم تجميع المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المعالجة ب SI CDK ستة وفقا لملصقات الفحص الخاصة بها ورسمها كرسوم بيانية لتلوين الحمض النووي النووي. يكشف هذا الاستخدام لتسميات بيانات الخلية عن العلاقة بين فحصي الخلية ومحتوى الحمض النووي في الخلايا. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم دائما تذكر اختبار معلمات تجزئة الصورة وضبطها عند استخدام ملف تعريف الخلية.

هذا مهم بشكل خاص عند استخدام ملفات صور جديدة أو غير مختبرة لأول مرة. حسنًا.