استخدام جهاز ميكروفلويديكس لتحفيز الميكانيكية وتصوير قرار عالية من C. ايليجانس

الهدف العام من هذه التقنية هو قياس كيفية استجابة الديدان الخيطية والخلايا العصبية الخاصة بها للمنبهات الميكانيكية الخارجية باستخدام إعداد رقاقة الموائع الدقيقة مع مشغلات الضغط. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء الميكانيكي والبيولوجيا الحسية مثل كيفية استجابة الخلايا والأنسجة للتحفيز الميكانيكي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل بشكل كاف من حركة الدودة بطريقة غير جراحية للسماح بالتصوير عالي الدقة مع الاستمرار في الوصول إلى بشرة الدودة للتحفيز الميكانيكي.

يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة تأثير الإشارات الميكانيكية على التطور. يمكن تطبيقه حتى على أنظمة أخرى مثل أس الأعضاء خارج الجسم الحي أو أخرى ذات حجم مماثل ل C.Elegans. قم بإعداد نظام مجهر للإثارة المتزامنة ل GCaMP و RFP.

أحد الخيارات هو مصدر ضوء سري ينقل الضوء السماوي والأصفر فقط. للعرض، استخدم هدفا 10 أضعاف الهدف وهدف التكبير العالي. أيضا ، أرسل الصورة إلى جهاز كمبيوتر عبر الكاميرا الرقمية.

بعد ذلك ، قم بتضمين مكعب الإزهار ، وإذا لزم الأمر ، مرشح الإثارة. أضف مرآة ثنائية اللون إلى المكعب تعكس الضوء السماوي والأصفر وتنقل الضوء الأخضر والأحمر. قم بإعداد مقسم شعاع بمرآة ثنائية اللون طويلة التمرير مع قطع عند 570 نانومتر.

أيضا ، قم بتوفير مرشح انبعاث تمرير النطاق للضوء الأخضر عند 525 نانومتر بعرض 50 نانومتر ومرشح انبعاث تمرير النطاق للضوء الأحمر عند 632 نانومتر بعرض 60 نانومتر. اعرض كلا الشعاعين في مجال رؤية الكاميرا. تأكد من عرض الجزء الأخضر على النصف العلوي من الشاشة ، والجزء الأحمر إلى الأسفل.

استخدم دائما رقائق الموائع الدقيقة التي يقل عمرها عن شهر واحد. للإعداد ، قم أولا بتحميل خزان تدفق الجاذبية باستخدام M9 المصفى. ضع الخزان على ارتفاع حوالي 60 سم فوق الشريحة وقم بتوصيله بمخرج رقاقة. بعد ذلك ، قم بتوصيل المخرج الآخر بحاوية نفايات بمدخلين ، وقم بتوصيل المدخل الثاني بحاوية النفايات بمضخة تمعجية.

قم بإجراء جميع التوصيلات باستخدام أنابيب البولي إيثيلين. بعد ذلك ، قم بتجميع التوصيلات البينية ، وأطوال الأنابيب 50 ملم مع موصلات أنابيب معدنية على كلا الطرفين. اضغط على كل من أصابع التشغيل الستة وفي مدخل الدودة.

الآن ، ضع الشريحة تحت البصريات. تأكد من ترك الوصلات المتصلة بالشريحة لأن نظام إدارة البيانات الشخصي سوف يتآكل بسرعة مع التلاعب المتكرر. من الضروري أن يتم إغلاق مشغل PDMS والأنبوب الذي يربط الشريحة بخزان الهواء بشكل صحيح لضمان التشغيل اللوني الجيد للحجاب الحاجز.

قبل تحميل ، تحقق من فقدان الضغط في رقاقة الموائع الدقيقة. قم بقياس انحراف الحجاب الحاجز عن طريق إجراء عدة دورات تشغيل عند الضغط المطلوب. ثم قارن القيم الكمية مع التنبؤات النظرية.

إذا لم تكن القيم المقاسة كما هو متوقع ، فتحقق من وجود تسرب في موصلات الأنابيب أو الأنابيب. قد يكون ل PDMS أيضا مرونة مختلفة بسبب نسبة بديلة من البوليمر الأساسي وعامل المعالجة ، أو يمكن أن تكون كتلة PD قديمة ومتشابكة بشكل مفرط. أعدت C.elegans متزامنة مع العمر للشباب أو البالغين في اليوم الأول كما وصفها Porta-de-la-Riva والشركة في منشور Jove الخاص بهم من عام 2012.

الآن ، اختر اثنين إلى خمسة شباب أو خنثى بعمر يوم واحد. يعد اختيار بالحجم الصحيح أمرا بالغ الأهمية. لن يتم محاصرة الصغيرة في القناة ، وسيكون من الصعب إزالة الكبيرة جدا ويمكن أن تسد الجهاز.

اسحب الديدان المقطوفة في قطرة من M9 المفلترة. بعد ذلك ، ارسمها إلى طول الأنابيب باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد دون سحبها إلى جسم المحقنة نفسها. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنبوب بالوصلة البينية عند مدخل الدودة للشريحة. بعد ذلك ، قم بتنشيط تدفق الجاذبية عن طريق فتح الصمام إلى الخزان وبدء تشغيل المضخة.

الآن ، راقب قناة الاصطياد بتكبير أربع مرات وادفع برفق إلى الجهاز. بعد تحميل في غرفة الانتظار ، استخدم المكبس لتدفق أحدها برفق إلى مقدمة قناة الاصطياد بحيث يدخل رأسها في الشكل المدبب للقناة. إذا لم تملأ الدودة المقطع العرضي للقناة بالكامل من الأنف إلى قرب نهاية الجسم ، فقم بإزالة الدودة.

في كثير من الأحيان ، تمر الديدان الصغيرة جدا مباشرة عبر الرقاقة دون أن تتعرض للحبس. إذا كان هناك حاجة إلى إزالة تم القبض عليه في قناة الاصطياد ، فما عليك سوى الضغط على مكبس المحقنة حتى تختفي الدودة من القناة ثم قم بتحميل دودة جديدة. بمجرد تحميل الدودة بشكل صحيح ، قم بالتبديل إلى وضع الإزهار وقم بزيادة التكبير.

لمنع التشبع ، تأكد من ضبط شدة الإثارة بناء على شدة الإزهار. تحقق مما إذا كان العصبية للخلايا العصبية ذات الأهمية تقع عبر الحجاب الحاجز لأحد المشغلات. يجب أن يكون هذا المشغل أيضا أمام جسم الخلية للخلايا العصبية.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط موضع عن طريق سحب المكبس أو الضغط عليه. إذا لم يساعد ذلك ، فقم بإزالة الدودة وقم بتحميل واحدة جديدة. أيضا ، إذا حدث حدوث التألق الذاتي حول الخلايا العصبية ، فاستبدل الدودة.

بمجرد تحميل الدودة بشكل صحيح ، ركز على جسم الخلية للخلايا العصبية المعنية ، ثم حدد المشغل الذي توجد فيه الرقاقة على جانبها الأمامي وقم بتوصيل هذا المشغل بمضخة الضغط القابلة للبرمجة باستخدام الوصلة البينية المرتبطة. إذا تطلبت التجربة قياس المسافة بين المشغل والخلية العصبية ، فقم بتركيب كلاهما في مجال الرؤية مع جدار القناة الموازي للحافة العلوية والسفلية للصورة. بعد ذلك ، حدد بروتوكول الضغط باستخدام مضخة الضغط القابلة للبرمجة.

ابدأ دائما بالتقاط 50 صورة على الأقل عند صفر كيلو باسكال لتحديد خط الأساس. ثم قم ببرمجة شكل موجة التحفيز والضغط. الآن ، قم بتشغيل بروتوكول التصوير والضغط.

أثناء التسجيل ، يجب أن تكون الخلايا العصبية محل الاهتمام هي ألمع بقعة في منطقة مساحتها 10 بكسل مربع. لا يمكن أن يتحرك أكثر من 10 بكسل في صورتين متسلسلتين ، ويجب أن يظل في مجال الرؤية. أثناء التسجيل ، قد تلاحظ تغيرات في شدة الإزهار عندما يتغير الضغط والمحركات.

هذا يشير إلى تحفيز ناجح للخلايا العصبية. بين المحفزات ، قم بتضمين 10 ثوان عند ضغط ثابت قدره صفر كيلو باسكال. من الممكن تسجيل الإشارات في وقت واحد من خلايا عصبية متعددة في مجال الرؤية طالما تم فصلها ب 10 بكسل على الأقل أثناء التسجيل بأكمله.

للاحتفاظ بالديدان لمزيد من الدراسة ، افصل منافذ الرقاقة باتجاه تدفق الجاذبية وحاوية النفايات. بعد ذلك ، اضغط برفق على المكبس حتى يتم دفع الدودة بأكملها عبر قناة المحاصرة إلى قناة التدفق ، واستمر في الضغط على المكبس حتى يظهر في قطرة خارج الشريحة. الآن ، افصل المحقنة بالأنبوب وشفط الدودة الموجودة في القطرة على لوحة أجار.

لإزالة دودة في القناة والتضحية بها، اضغط على المكبس حتى يتم دفع الدودة بأكملها عبر قناة الاصطياد إلى قناة التدفق. بعد ذلك ، سوف تتدفق الدودة من الرقاقة إلى حاوية النفايات. بعد إعداد رقاقة الموائع الدقيقة ، تم اختبار انحراف الحجاب الحاجز.

كانت القيم المقاسة قابلة للتكرار مع اختلاف طفيف لا يتجاوز ميكرون واحد عند 450 كيلو باسكال من الضغط. بعد إدخال الديدان في مدخل الرقاقة ، تم تقديم جلد واحد داخل قناة الاصطياد إلى المحركات الستة. مع هذا التصميم ، لا يمكن عادة تثبيت الخلايا العصبية PLM تماما ، لذلك فهي حرة في التحرك بشكل جانبي ورأسي.

على الرغم من أن التنشيط الناجح للخلايا العصبية PLM أمر ممكن ، إلا أن تسجيل عابرات الكالسيوم منها أمر صعب بسبب حركة الذيل. بمجرد وضعه في مكانه ، تم تحفيز باستخدام أحد المشغلات الستة الموضوعة لتوصيل المحفزات الميكانيكية لكل من شبكات TRN الستة. تم تقديم أحد المحفزات الثلاثة المختلفة لمدة ثانيتين.

تعليق عند 275 كيلو باسكال ، منحدر يصل إلى 275 كيلو باسكال أو طنين يتكون من جيب 75 كيلو باسكال 10 هرتز متراكب مع خطوة 275 كيلو باسكال. فجوات مدتها 10 ثوان بدون ضغط تفصل المحفزات. قامت منحدرات الضغط وخطوات الضغط بتنشيط TRNs فقط إذا حققت المحفزات ضغوطا أعلى من 400 كيلو باسكال ، في حين أن محفزات الطنين تنشط بقوة كل TRN.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس دقائق لكل دودة. من المهم أن تتذكر أن الختم الضعيف بين الرقاقة والغطاء ، أو بين الشريحة والموصلات البينية سيؤدي إلى تسرب الجهاز وفشله. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الجهد أو التوصيل المستهدف للمنبهات الميكانيكية إلى الخلايا العصبية المختلفة من أجل توصيف الاستجابة الميكانيكية لمستقبلات الألم.

أيضا ، نظرا لأنه يمكن استعادة بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن الطفرات المعيبة في استجابتها للمنبهات الميكانيكية. لا تنس أن العمل مع الغازات المضغوطة والمواد الكيميائية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. اتخذ الاحتياطات مثل ارتداء ملابس الحماية الشخصية والعمل في أغطية الدخان عند الضرورة لتجنب هذه المخاطر.