عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

الهدف العام من هذه التقنية هو استخدام العزل المغناطيسي المناعي لاختيار O4 قليلة التغصن الإيجابية من صغار الفئران حديثي الولادة لتحليل الثقافة في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلوم العصبية المتعلقة بدراسة الأمراض التي تصيب المايلين وتكوين النخاع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل تحضير ثقافة الخلايا قليلة التغصن النهائية بنقاء أكبر من 80٪ في حوالي ساعة ساعات.

ابدئي باستخدام مقص تشريح صغير لقص الجلد على طول خط الوسط لفروة الرأس من خمسة إلى سبعة فأر نهار بعد الولادة. اسحب رفرف الجلد لكشف الجمجمة ، وقم بقص الجمجمة بعناية على طول خط الوسط من الفتحة في الخلف إلى المنطقة الأمامية. من الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة ، اقطع باتجاه كل تجويف في العين على طول قاعدة العظم واستخدم ملقطا دقيقا لإثارة القشرة برفق بعيدا عن الدماغ المتوسط.

بعد ذلك ، انقل القشرة إلى طبق زراعة أنسجة 60 ملم يحتوي على سبعة ملليلتر من B-27 Neurobasal A Medium. عندما يتم جمع كل الأدمغة ، انقل القشرة إلى طبق جديد لزراعة الأنسجة بحجم 60 ملم يحتوي على خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت للتفكك ، واستخدم شفرة مشرط رقم 15 لتقطيع القشرة إلى قطع مليمتر مكعب واحد. احتضان قطع الدماغ في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة.

ثم أضف ملليلتر واحد من مصل نمو الأبقار لوقف التفاعل الأنزيمي. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، انقل ملاط الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا وقم بفصل أنسجة المخ برفق من ست إلى ثماني مرات باستخدام سحب العينات. اترك قطع الأنسجة المنفصلة تستقر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من Neurobasal A Medium ، المكملة بمصل نمو الأبقار و DNase I إلى الأنسجة ، واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لفصل الأنسجة بلطف مع مزيد من سحب العينات. كما ترى ، فإن قوة سحب العينات المناسبة ضرورية لضمان إنتاجية عالية من الخلايا القابلة للحياة.

إذا كان سحب العينات صعبا للغاية، فقد تكون قابلية الاستخدام منخفضة. بينما إذا كانت سحب العينات لطيفة جدا ، فقد يكون العائد الخلوي منخفضا. اترك قطع المناديل تستقر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وأضف ثلاثة ملليلتر من Neurobasal A Medium الطازج ، مع استكمال مصل نمو الأبقار و DNase I إلى الأنسجة. افصل أنسجة المخ برفق باستخدام طرف ماصة P-1000 حتى لا يتبقى جزء كبير من الأنسجة، مع الحرص على تجنب الفقاعات. استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وقم بإحضار الحجم النهائي للتعليق أحادي الخلية إلى 30 مل مع Neurobasal A Medium الطازج ، مع استكمال مصل نمو البقر و DNase I. وحبيبات الخلايا العصبية عن طريق الطرد المركزي.

قم بإزالة جميع المواد الطافية العكرة باستثناء آخر خمسة إلى 10 ميكرولترات وأضف ثلاثة ملليلتر من Neurobasal A Medium المكمل بمصل نمو الأبقار إلى الخلايا. أعد تعليق الخلايا بعناية ورفع الحجم النهائي إلى 15 مل مع Neurobasal A Medium الطازج الذي يحتوي على 10٪ مصل نمو الأبقار. قم بتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر ، وارفع الحجم النهائي إلى 30 مل باستخدام Neurobasal A Medium الطازج الذي يحتوي على 10٪ مصل نمو البقر.

بعد ذلك ، قم بتقسيم تعليق الخلية المفلترة بين أنبوبين مخروطيين سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. وأعد تعليق الكريات في 2.5 مل من عازلة فرز الخلايا المغناطيسية المثلجة قبل تجميع الخلايا. بعد العد ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وأعد تعليق الحبيبات في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية الطازجة لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من الخرز المضاد ل 04 لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع ، واخلط محلول الخلية بنقرة لطيفة. بعد 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع نقرة لطيفة كل خمس دقائق ، أضف برفق ملليلترين من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع للغسيل بالطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط بالفراغ بعناية. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية الطازجة لكل مرة 10 إلى الخلايا السبع ، وضع عمود فرز الخرز المغناطيسي بحجم مناسب في الفاصل المغناطيسي المقابل له.

ضع مصفاة 40 ميكرون على العمود واشطف المصفاة مسبقا بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية ، واترك المخزن المؤقت يمر عبر العمود دون ترك العمود يجف. أضف الخلايا إلى المصفاة ، متبوعا بغسل مليلتر واحد باستخدام Magnetic Cell Sorting Buffer. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية لكل غسلة ، ومرة واحدة باستخدام وسيط انتشار الخلايا قليلة التغصن.

بعد ذلك ، انقل العمود إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، واستخدم المكبس لطرد خمسة ملليلتر على الفور من وسيط انتشار الخلايا قليلة التغصن الطازج عبر العمود. بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى كثافة طلاء مناسبة ، واستبدل اللامينين من زلات الغطاء المطلي مسبقا في صفيحة 24 بئر ب 100 ميكرولتر من وسط انتشار الخلايا قليلة التغصن. احتضان الخلايا قليلة التغصن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة لا تزيد عن 45 دقيقة لتعزيز التصاق الخلايا قليلة التغصن بزلات الغطاء.

بعد ذلك ، قم بإغراق كل بئر من صفيحة 24 بئرا ب 500 ميكرولتر من وسيط انتشار الخلايا قليلة التغصن لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استبدل المواد الطافية بوسيط تمايز الخلايا قليلة التغصن ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة حتى تصبح جاهزة للتثبيت. بعد 24 ساعة من الطلاء ، تبدو الخلايا ثنائية الأقطاب أو ثلاثية الأقطاب تحت الفحص المجهري التبايني الطوري ، وهي سمة مميزة لانتشار الخلايا قليلة التغصن في المرحلة المبكرة.

يظهر تلطيخ التألق المناعي أنه بعد 24 ساعة من الطلاء ، تظهر غالبية هذه الخلايا قبل قليلة التغصن أيضا وضع العلامات على NG2 و O4 ، في حين أن وضع العلامات باستخدام GFAP والأجسام المضادة المضادة ل 01 أقل شيوعا ، مما يشير إلى أن غالبية الخلايا في هذه المرحلة ae الخلايا قبل قليلة التغصن مع عدد قليل قليل التغسنين غير الناضجة أو الناضجة. في 72 ساعة ، يبدو أن مورفولوجيا الخلايا قليلة التغصن أكثر تعقيدا مما كانت عليه في 24 ساعة ، وهناك تواتر أقل بكثير من الخلايا الإيجابية لعلامة الخلايا قليلة التغصن المبكرة ، NG2. أيضا ، تظهر معظم الخلايا تسمية O4 ، وما يقرب من نصف الخلايا ملطخة بجسم مضاد 01 في هذه المرحلة ، مما يشير إلى أن الخلايا تتمايز إلى نمط ظاهري أكثر نضجا.

والجدير بالذكر أن وجود الخلايا النجمية لا يزال منخفضا للغاية. تشير هذه النتائج إلى أنه بمرور الوقت ، تكون الخلايا قليلة التغصن المعزولة مغناطيسيا قادرة على التمايز في المختبر إلى المرحلة الثالثة من النضج مع القليل جدا من التلوث لأنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا قليلة التغصن الأولية من صغار الفئران حديثي الولادة باستخدام العزل المناعي المغناطيسي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أربع ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. شكرا للمشاهدة. حظا سعيدا في تجاربك.