عزل أنواع الخلايا المتعددة عن دماغ الفأر عن طريق التجانس الميكانيكي

ابدأ بوضع مكونات طاحونة الأنسجة على الجليد. يشتمل هذا الجهاز على ملاط ومدقتين بأقطار مختلفة.

صب محلول ملح مبرد في الهاون ثم أضف أنسجة دماغ الفأر.

يحافظ المخزن المؤقت على التوازن التناضحي ، ويحافظ على بنية الخلية ووظيفتها.

اطحن الأنسجة بضربات لطيفة متعددة باستخدام المدقة ذات القطر الأصغر ، والتي تقص الأنسجة ميكانيكيا إلى قطع أصغر.

بعد ذلك ، قم بالسكتة الدماغية باستخدام مدقة ذات قطر أكبر ، مما يسهل المزيد من انهيار الأنسجة إلى الخلايا المكونة لها.

انقل الخليط إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي.

قم بإزالة المادة الطافية.

أضف الملح المبرد والدوامة لكسر كتل الخلايا والمايلين.

بعد ذلك ، أضف وسيط تدرج الكثافة وجهاز طرد مركزي.

بسبب الاختلافات في الشكل والكتلة ، ستستقر الخلايا في الطبقة السفلية ، بينما يتراكم الحطام والمايلين في الطبقة العليا.

تخلص من المادة الطافية.

أضف حلا مناسبا للحصول على تعليق متعدد الخلايا لمزيد من الاستخدام.

لتجانس الأنسجة ، أضف 3 ملليلتر من HBSS المبرد مسبقا إلى الملاط الزجاجي المبرد مسبقا لمطحنة الأنسجة Dounce ، وانقل نصف أحد الدماغ المحصود إلى الهاون. نقع الأنسجة برفق ب 10 ضربات من المدقة أ ، متبوعة ب 10 ضربات من المدقة B ، وانقل الخليط المتجانس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا.

املأ الأنبوب إلى حجم نهائي قدره 10 ملليلتر باستخدام HBSS المبرد مسبقا للطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 7 ملليلتر من HBSS الطازج مع الدوامة قبل وضع العينة على الجليد. لإزالة الحطام ، أضف 3 ملليلتر من محلول متساوي التوتر المبرد مسبقا إلى كل عينة مهضومة أو متجانسة ، وقم بتدوير العينات برفق للتأكد من خلطها بشكل متجانس.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات وإزالة القرص الأبيض من الحطام والمايلين العائم على سطح المحلول بعناية. عندما يتم التخلص من الحطام ، اجمع كل ما عدا آخر 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب دون إزعاج الكريات. أعد تعليق كل حبيبات في 1 مليلتر من محلول FACS / BL لنقلها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 ملليلتر.

بعد الطرد المركزي بمحلول الجسيمات ، من المهم إزالة قرص الحطام والمادة الطافية بعناية فائقة ، دون إزاحة حبيبات الخلية ، لتجنب فقدان العينة.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية بعناية من كل أنبوب وأعد تعليق الكريات في 350 ميكرولتر من FACS / BL الطازج لكل أنبوب.