قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات مختلفة تحت الخلايا في دماغ الفئران

ابدأ بالأجزاء النووية والمشبكية تحت الخلوية التي تم جمعها من اللوزة الجانبية لأدمغة كل من الفئران المشروطة بالخوف.

كل جزء تحت الخلوي على تركيزات متفاوتة من البروتيازومات 20S ، وهو اللب التحفيزي لمركب البروتيازوم المسؤول عن تحلل البروتينات الخلوية غير المرغوب فيها.

أضف عازلة فحص تحتوي على ATP وركيزة ببتيد فلوروجينيك إلى العينات واحتضنها.

في وجود ATP ، يشق البروتيازوم الببتيد الفلوروجينيك ، ويطلق جزيئات فلوروجينيك حرة.

باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس شدة التألق على فترات منتظمة.

حدد كمية التألق من خلال مقارنته بالتركيزات القياسية المعروفة للجزيء الفلوري.

تتناسب شدة التألق مع نشاط البروتيازوم في العينة.

النشاط البروتيازمي المتزايد في الجزء النووي للفئران المكيفة بالخوف إلى تغييرات في التعبير الجيني المرتبط بالذاكرة ، بينما يشير انخفاض النشاط في الجزء المشبكي إلى تغيرات في تعبير البروتين المشبكي الضروري للحفاظ على الذاكرة على المدى الطويل.

لإعداد الفحص ، قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية واستمر في الجري. اضبط الإثارة على 360 نانومتر والانبعاث على 460 نانومتر. إذا كانت لوحة البئر 96 المستخدمة واضحة ، فاضبط موضع البصريات على الأسفل. إذا تم استخدام لوحة داكنة سعة 96 بئرا ، فاضبط موضع البصريات على الأعلى. قم ببرمجة تشغيل حركي مع وقت 2 ساعة ، والمسح الضوئي كل 30 دقيقة.

أعد تكوين المخزن المؤقت للفحص 20s 10x المقدم في المجموعة ب 13.5 مل من الماء عالي النقاء. أضف 14 ميكرولترا من 100 مللي مولار ATP إلى المخزن المؤقت 1x الآن. هذا يعزز بشكل كبير نشاط البروتيازوم في العينات ويحسن موثوقية الفحص. أعد تكوين معيار AMC الموجود في المجموعة مع 100 ميكرولتر من DMSO. قم بتنفيذ الخطوات باستخدام معيار AMC في الظلام أو في ظروف الإضاءة المنخفضة ، حيث أن المعيار حساس للضوء.

قم بإنشاء منحنى قياسي ل AMC من سلسلة من تركيزات AMC العالية إلى المنخفضة. سيتم استخدام هذا المنحنى لمعايرة قارئ الألواح وتحليل نشاط البروتيازوم في العينات المتجانسة. أعد تكوين ركيزة البروتيازوم المتوفرة في المجموعة مع 65 ميكرولتر من DMSO. قم أيضا بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظروف الإضاءة المنخفضة ، حيث أن الركيزة حساسة للضوء.

ثم قم بإنشاء تخفيف من 1 إلى 20 من ركيزة البروتيازوم في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل ، باستخدام مخزن مؤقت للفحص 20 S. أضف كمية طبيعية من العينات المرغوبة إلى لوحة 96 بئرا. قم بتشغيل كل نموذج بشكل مكرر. تختلف كمية العينة المطلوبة بناء على تحضير الأنسجة. بشكل عام ، 10 إلى 20 ميكروغرام كافية لأي جزء تحت الخلوي.

ارفع حجم البئر العينة إلى 80 ميكرولتر بالماء عالي النقاء. يعتمد المبلغ المضاف على حجم العينة المضافة. في بئرين منفصلين ، أضف 80 ميكرولتر من الماء وحده. ستكون هذه هي فراغات الفحص. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص 20 S إلى كل بئر ، بما في ذلك فراغات الفحص. استخدم مكرر أو ماصة آلية لضمان حجم فحص متسق عبر الآبار.

أطفئ الأنوار أو ادخل إلى غرفة مظلمة. أضف كل 100 ميكرولتر من معايير AMC المخففة إلى بئر جديد ، باستخدام بئر واحد لكل معيار. في الظلام ، استخدم مكرر أو ماصة آلية لإضافة 10 ميكرولتر من ركيزة البروتيازوم المخففة إلى الآبار التي تحتوي على فراغات عينة وفحصة ، ولكن ليس معيار AMC. ضع اللوحة في قارئ اللوحة وابدأ التشغيل الحركي.