تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية المعوية وأنشطة الخلايا الدبقية في الضفيرة العضلية المعوية في القولون الفأر

خذ غرفة تصوير تحتوي على نسيج الضفيرة العضلية المعوية القولون المجمد للفأر ، والذي يضم الضفائر العقدية المكونة من شبكات من الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية.

يتم تصنيف هذه الخلايا بمؤشر الكالسيوم الذي يتألق عند ارتباط الكالسيوم.

بعد ذلك ، ضع الغرفة على مرحلة المجهر الفلوري. قم بتفريخ الغرفة بمخزن مؤقت مسخن مسبقا يحتوي على مثبطات لقمع تقلصات العضلات أثناء التصوير.

باستخدام المجهر ، حدد المناطق العقدية السليمة التي تظهر مضان موحد.

الحصول على صور الفلورسنت لقياس نشاط خط الأساس ، مما يوفر مرجعا لمستويات الكالسيوم داخل الخلايا.

قم بتفريم الأنسجة بناهض مستقبلات لتنشيط المستقبلات العصبية ، مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم داخل الخلايا وزيادة شدة التألق.

يحفز التنشيط العصبي بشكل غير مباشر الخلايا الدبقية المحيطة ، مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم وزيادة لاحقة في التألق.

التقط صورا فلورية بفاصل زمني لقياس التغيرات في شدة التألق ، والتي تشير إلى ديناميكيات الكالسيوم ونشاط الإشارات في كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية بالنسبة لمستويات خط الأساس.

أثناء الحضانة ، قم بعمل عازلة كرب معدلة وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول ، وأضف 3 نيكارديبين ميكرومولار و 1 سكوبولامين ميكرومولار لتثبيط تقلصات العضلات أثناء الكالسيوم 2 بالإضافة إلى التصوير في تشريح الجبل بالكامل. ضع غرفة التسجيل تحت المجهر الفلوري ، وباستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية مع خزانات حقنة ساخنة متعددة ، قم بإنشاء معدل نضح مستمر من 2 إلى 3 ملليلتر في الدقيقة من 37 درجة مئوية من عازلة كريب. تأكد من منع تكوين فقاعة الهواء في كل من خط الشفط المتصل بمصيدة الفراغ. اجعل الضفيرة المطلوبة في بؤرة التركيز تحت إضاءة المجال الساطع. تجنب الإفراط في تعريض الأنسجة، مما قد يؤدي إلى التبييض الضوئي.

افحص تحميل الفلوروفور داخل العقد واختر العقد السليمة للتصوير. ستظهر العقد التالفة غير الصحية التألق الذاتي أو مورفولوجيا ثقب ويجب عدم استخدامها للتصوير. بمجرد تحديد العقدة ، قم بتحويل مسار الضوء إلى الكاميرا واحصل على صورة حية باستخدام برنامج الحصول على الصور. تأكد من أن العقدة في بؤرة التركيز واضبط معدل الحصول على الصورة وأوقات التعرض.

ستختلف معدلات الحصول على الصور وأوقاتها اعتمادا على الأحداث التي يرغب المحققون في تسجيلها. بالنسبة لمعظم التجارب ، يتم الحصول على الصور تقليديا عند 0.5 إلى 1 هرتز للخلايا الدبقية ، وما يصل إلى 2 إلى 10 هرتز للخلايا العصبية ، لأن عابرات الكالسيوم الدبقية ليست سريعة مثل الخلايا العصبية العابرة للكالسيوم.

ابدأ التسجيل وقم بإنشاء النشاط الفسيولوجي الأساسي للعقدة المختارة في حالة عدم وجود محفزات تجريبية لمدة 30 ثانية. ثم استخدم الأدوية الدافئة مسبقا ذات الأهمية ، مثل ناهضات المستقبلات والمضادات ، باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية بمعدل 2 إلى 3 ملليلتر في الدقيقة وفقا لبروتوكول محسن لدواءك. أوقف التسجيل واعرض فيلم اللقطات المتتابعة للتجربة.

حدد بعناية مناطق الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، باستخدام برنامج تحليل الصور المناسب.

أخيرا ، استخدم برنامج التصوير المناسب لتطبيع ومقارنة شدة التألق للمناطق ذات الأهمية مقابل قيمة خط الأساس الأولية. تتناسب التغييرات في التألق الطبيعي طرديا مع التغيرات في الكالسيوم.