الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد ثنائي الفوتون لدراسة النشاط العصبي والاتصال في نموذج الفأر

ابدأ بفأرة مستيقظة موضوعة تحت مجهر ثلاثي الأبعاد ثنائي الفوتون مدمج مع معدلات الضوء المكاني أو SLMs.

يحمل الفأر لوحة رأس مزروعة مسبقا.

في دماغ الفأر ، تعبر الخلايا العصبية عن القنوات الحساسة للضوء الأحمر ومؤشرات الكالسيوم الفلورية الخضراء التي ترتبط بأيونات الكالسيوم.

لدراسة النشاط العصبي والاتصال ، قم بتعيين معلمات التصوير.

استخدم ليزر 920 نانومتر لإثارة المؤشرات المرتبطة بالكالسيوم داخل الخلايا العصبية. التقط صورة مضان الخلايا العصبية بأقل قدر من التلف الضوئي.

أعد ضبط معلمات التصوير وركز شعاع ليزر قريب من الأشعة تحت الحمراء.

تشكل

SLMs شعاع الليزر في أنماط ثلاثية الأبعاد دقيقة تسمح بالتركيز الانتقائي على الخلايا العصبية المستهدفة في نقاط متعددة.

هذا يحفز القنوات الحساسة للضوء ، ويسبب تدفق أيونات الكالسيوم ، ويعزز مضان الخلايا العصبية المستهدفة.

تنقل الخلايا العصبية المستهدفة المنشطة الإشارات إلى الخلايا العصبية المتصلة وتزيد من مضان الخلايا العصبية المتصلة.

مرة أخرى ، التقط صورة ثنائية الفوتون. يؤكد التألق المتزايد في الخلايا العصبية المستهدفة والمتصلة نشاط الخلايا العصبية والاتصال.

بعد وضع الماوس تحت المجهر وإجراء التصوير ثنائي الفوتون ، افتح برنامج التصوير التجاري. في وضع التصوير المباشر ، اضبط جهد كاشف الصورة وقوة ليزر التصوير ، لتحسين سطوع الخلايا العصبية التي تعبر عن GCaMP6m-P2A-ChRmine. التقط صورا للخلايا العصبية التي تعبر عن هذه البروتينات ، ثم قم بإضاءة الخلايا العصبية المحددة باتباع الإجراء الموضح سابقا.

للتحقيق في الاتصال الوظيفي داخل الخلايا العصبية من الطبقة 2 و 3 ، استخدم معدل الضوء المكاني لتوليد أنماط ثلاثية الأبعاد للتحفيز البصري الوراثي. واجمعها مع تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون. اضبط شدة ليزر التصوير على 920 نانومتر عند 10 إلى 20 مللي واط ، ومجال الرؤية على 256 ميكرومتر × 256 ميكرومتر. يقاس على عمق 100 إلى 150 ميكرومتر من السطح القشري.

اضبط وقت بقاء البكسل على 1.5 ميكروثانية ل 2 هرتز ، أو 100 نانو ثانية ل 30 هرتز. استخدم كلا من 2 هرتز و 30 هرتز كمعدل إطار للتصوير لمعرفة ما إذا كان حافز ثلاثي الأبعاد واحد يسبب استجابة الكالسيوم في الخلايا العصبية. اضبط شدة ليزر التحفيز الثلاثي الأبعاد الذي يحفز خلية عصبية واحدة عند 10 مللي واط ، وهو ما يكفي للحث على النشاط العصبي.

في الوقت نفسه ، قم بتصوير استجابة أيون الكالسيوم عند 920 نانومتر ، مع 10 محفزات ثلاثية الأبعاد عند 1,040 نانومتر وثماني ثوان لمدة 50 مللي ثانية بعد فترة أساسية مدتها 10 ثوان.