الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين تحليل مثيلة DNA لثنائيات النوكليوتيد CPG عن طريق التسلسل الجينومي للـ DNA المحول بواسطة السلفيت. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تغيير طبيعة الـ DNA مزدوج السلسلة، بحيث يمكن أن يحدث تفاعل تحويل البيسلفيت. وتتمثل الخطوة الثانية في تحويل جميع السيتوسينات غير الممثيلة في الـ DNA الجينومي إلى يوراسيل عن طريق إزالة الأمين بواسطة البيسلفيت.

يتضمن هذا التفاعل ثلاث مراحل. الأولى هي سلفنة بقايا السيتوزين عن طريق إضافة B sulfite إلى الرابطة المزدوجة بين الكربون الخامس والسادس. ثانياً، تؤدي عملية نزع الأمين مائياً من السيتوزين بواسطة مشتق السلفيت إلى إنتاج SSL بواسطة مشتق السلفيت، وثالثاً، تؤدي إزالة مجموعة السلفونات عن طريق المعالجة القلوية إلى تكوين بقايا SSL.

بعد ذلك، يتم تضخيم المنطقة المستهدفة باستخدام بادئات متخصصة لتحويل البيسلفيت وتفاعل PCR. وتتمثل الخطوة النهائية في استنساخ وتسلسل ناتج الـ PCR للحصول على دقة النيوكليوتيد الواحد لمواقع الميثيل عبر جزيء DNA. وفي النهاية، تظهر النتائج ميثيلية ثنائيات النيوكليوتيد CPG في DNA الجينومي من خلال استغلال الحساسية المتزايدة للـ cytokine مقابل 5-methylcytosine لعملية نزع الأمين بالبيسلفيت تحت الظروف الحمضية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل الدم بطريقة Southern، في أنها تتيح دقة على مستوى النيوكليوتيد الواحد لعملية مثيلة الـ d. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الوراثة فوق الجينية، مثل دور مثيلة الـ DNA في الأمراض البشرية مثل السرطان. ولتحضير عينات الـ DNA لعملية التحويل بـ bi sulfite، قم أولاً بحضن 2 µg من الـ genomic DNA مع bi sulfite، ومحلول DNA lysis buffer، ليصل الحجم الإجمالي إلى 18 µL لمدة ساعة واحدة عند 37 °C.

ثم قم بمسخ الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي عن طريق إضافة 2 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 3 M المُحضّر حديثاً للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.3 M. تُحضن العينات عند 37 °C لمدة 15 دقيقة في حمام مائي، يليه تحضين عند 90 °C لمدة دقيقتين. وباستخدام كتلة تسخين، ضع الأنابيب فوراً على الثلج لمدة خمس دقائق، ثم قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة 10 ثوانٍ عند 10,000 ×g لضمان استقرار الـ DNA في قاع الأنبوب؛ وبذلك تصبح عينات الـ DNA الممسوخة جاهزة لعملية نزع الأمين من الخلايا البائية، والتي سيتم توضيحها لاحقاً.

قبل تفاعلات الكبرتة وإزالة الأمين بالتحلل المائي، قم بتحضير محاليل طازجة من كينول بتركيز 10 millimolar ومحاليل مشبعة من ميتا بيسلفيت الصوديوم عند pH 5.0. وبما أن ميتا بيسلفيت الصوديوم محلول مشبع، فقد تبقى بعض الكتل الصغيرة غير ذائبة. أضف 208 microliters من ميتا بيسلفيت الصوديوم و12 microliters من الكينول إلى 20 microliters من DNA الممسخ، ليصل الحجم النهائي إلى 240 microliters.

قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الخض (Vortex) ثم قم بطردها مركزياً لمدة 10 seconds لضمان استقرار جميع القطيرات في قاع الأنبوب. غطِّ العينات بطبقة من الزيت المعدني. قم بتحضين العينات عند درجة حرارة 55 °C في حمام مائي لمدة تتراوح من 4 إلى 16 ساعة، وذلك اعتماداً على كمية وجودة الـ DNA المراد تحويله.

من المهم أن تتم عملية التحويل بالبيسلفيت في الظلام لتجنب الأكسدة. وفي نهاية وقت الحضانة المناسب، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق لضمان استقرار كل السائل في قاع الأنبوب. بعد ذلك، اسحب محلول DNA بعناية بواسطة الماصة من قاع الأنبوب دون سحب أي من الزيت المعدني.

بالنسبة للخطوات التالية، يستخدم مختبرنا نظام Promega Wizard لتنقية DNA. أضف 1 mL من الراتنج (resin) إلى عينات DNA، واقلب الأنبوب للمزج، ثم انقل المحلول باستخدام الماصة إلى محقنة متصلة بعمود إزالة الأملاح. وأخيرًا، لإزالة أي أيونات بيسلفيت حرة، مرر DNA المعالج بالبيسلفيت عبر عمود إزالة الأملاح وأذبه في 50 µL من ماء Milli Q.

تتمثل الخطوة التالية في إزالة مجموعة البيسلفيت من حلقة اليوراسيل عن طريق إزالة الملوحة. ولتحقيق ذلك، أضف 5.5 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 3 M المحضر حديثاً إلى كل عينة DNA معالجة بالبيسلفيت للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.3 M. بعد ذلك، يتم تحضين العينات عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة.

قم بطرد العينات مركزياً لفترة وجيزة، ثم أضف 1 µL من TRNA إلى كل عينة. عادل المحلول بإضافة خلات الأمونيوم لتصل إلى تركيز نهائي قدره 3 M. بعد ذلك، قم بترسيب DNA باستخدام الإيثانول.

أضف 330 µL من الإيثانول 100% المبرد بالثلج، واخلط جيداً عن طريق القلب. اترك المزيج عند درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة، ثم قم بالطرد المركزي عند 14,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بإزالة كافة آثار الراشح، واترك الـ DNA المترسب ليجف في الهواء لمدة 20 دقيقة تقريباً.

بعد التجفيف بالهواء، يكون من المستحيل تقريبًا رؤية الكتلة المترسبة؛ لذا قم بإعادة تعليق كتلة DNA في 50 µL من 0.1 XTE أو الماء، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين تقريبًا، وخلال هذا الوقت، قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الـ vortex من حين لآخر لضمان ذوبان DNA، يليه طرد مركزي سريع. وبمجرد ذوبان DNA، يمكن تخزينه في درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح من سنة إلى 10 سنوات، اعتمادًا على كمية وجودة DNA، أو استخدامه على الفور. وبالنسبة لتضخيم PCR، فإن تحسين البادئات (primer optimization) هو الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء.

لذلك، تم توفير الإرشادات التالية للمساعدة في ضمان نجاح تصميم البادئات. ولتوضيح هذه الإرشادات، تم تحويل التسلسل المستهدف بواسطة السلفيت بحيث تظهر السيتوزينات المحولة عند كتابتها على شكل Ts زرقاء، بينما تظهر مواقع CPG غير المحولة على شكل cgs حمراء. يجب أن يتراوح طول البادئات بين 24 إلى 30 زوجًا قاعديًا لضمان النوعية. كما يجب أن يكون للبادئات درجة حرارة انصهار (TM) متوقعة مماثلة تزيد عن 50 °C وألا تختلف بأكثر من درجة إلى درجتين مئويتين.

يجب أن تحتوي البادئات على نسبة تتراوح تقريباً بين 25% من قواعد C و T لضمان خصوصية التحويل. يجب أن تكون القاعدة النهائية في الطرف '3 عبارة عن C إلى T لضمان تضخيم الحمض النووي DNA المحول. كما يجب تجنب وجود ثنائيات النوكليوتيد CPG في تسلسل البادئة لتفادي التحيز المحتمل تجاه القوالب الميثيلية أو غير الميثيلية أو غير المحولة. ومع ذلك، إذا كان ذلك لا مفر منه، فيجب استبدال السيتوزين في موقع CPG بـ Y للمساعدة في ضمان تضخيم غير متحيز للحمض النووي DNA المحول.

أخيرًا، قم بتصميم مجموعات بادئات متداخلة أو شبه متداخلة لضمان نوعية أو حساسية تفاعل PCR إذا لزم الأمر. قم بتحضير مخاليط تفاعل تضخيم PCR في حصص مقدارها 25 µL لغرض التحسين. يحتوي كل تفاعل على DNA جينومي محول بالكبريتيت، وبادئات DPS، وكلوريد المغنيسيوم، وكلوريد البوتاسيوم، وتريس هيدروكلوريد pH 8.3، وبوليميراز Taq لاختبار انحياز التضخيم للمادة الميثيلية أو غير الميثيلية.

استخدم عينة ضابطة محولة بالكامل بواسطة البيسلفيت، تتكون من 50% حمض نووي ميثيلي و50% غير ميثيلي، لاختبار تضخيم PCR التناسبي مع تحويل البيسلفيت. باستخدام بادئات محددة ومزيج تفاعل PCR في جهاز دورة حرارية ذو تدرج حراري، قم بضبط تفاعل التشغيل في تدرج يزيد أو ينقص بمقدار 3 °C عن درجة حرارة الانصهار (TM) للبادئة عبر 8 إلى 10 أنابيب، ثم قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الفورتيكس ودورانها لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق قبل وضعها في جهاز الدورة الحرارية. يوضح هذا الشكل هلام أغاروز مع ملف تضخيم PCR بتدرج حراري من خليط من DNA ميثيلي بنسبة 50% وغير ميثيلي.

لقد عولجت نواتج تضخيم PCR في المسارات المحددة بـ T (المسارات الثاني والخامس والثامن) باستخدام إنزيم قطع يحلل الحمض النووي المُمثيّل فقط. ويجب أن تؤدي ظروف تضخيم PCR المثالية إلى تضخيم النواتج المُمثيّلَة وغير المُمثيّلَة بنسب متناسبة وبدون انحياز، مما ينتج عنه كمية متساوية من نواتج PCR المقطوعة وغير المقطوعة كما هو موضح هنا. وتكون ظروف الدورة الحرارية المثلى للتضخيم غير المنحاز عند 55.6 degrees Celsius. ويمكن تحليل التحويل الكامل للحمض النووي المعالج بالبيسلفيت عن طريق الهضم باستخدام إنزيم متخصص في موقع السيتوزين، والذي يحلل فقط الحمض النووي غير المحوّل في المسارات الثالث والسادس والتاسع.

يُستدل هنا على اكتمال عملية تحويل الحمض النووي (DNA) باستخدام البيسلفيت من عدم وجود حمض نووي مقطوع في جميع المسارات الثلاثة، المسارات الثالث والسادس والتاسع. يُظهر مخطط التفكك في الوقت الحقيقي هذا نسبة متساوية من الحمض النووي الميثيلي وغير الميثيلي (الخط البرتقالي المحمر، خليط 50 50) مقارنة بتضخيم التحكم للحمض النووي الميثيلي بالكامل (الخط الوردي m) والحمض النووي غير الميثيلي (الخط الأخضر U)، واللذين يتفككان عند 82.9 °C و 86.9 °C على التوالي. ويشير هذا إلى عدم وجود انحياز في التضخيم بناءً على درجة الحرارة التي تتفكك عندها الجزيئات المختلفة.

يمكن تصور قطع PCR الناتجة عن تضخيم العينات المعالجة بـ bi sulfite عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأغاروز ومن ثم تسلسلها. يظهر هنا مباشرة مخطط تتبع التسلسل لثلاثة خطوط خلوية مختلفة مع تظليل مواقع CPG باللون الأصفر؛ حيث يُظهر الخط الخلوي X ميثيلية بنسبة 100% في جميع مواقع CPG الثلاثة، بينما يُظهر الخطان الخلويان Y و Z درجات متفاوتة من الميثيلية كما يتضح من إشارات GA المتداخلة الموضحة هنا. الشكل 4 A هو مخطط تتبع التسلسل لثلاثة خطوط خلوية مختلفة مع تظليل مواقع CPG باللون الأصفر.

بعد إجراء التسلسل المباشر للمستنسخات الفردية، يمكن جدولة حالة الميثيلة للجزيئات الفردية في خريطة بيسلفيت. ولتصوير تباين الميثيلة، يتم إظهار كثافة الميثيلة في مواقع CpG الفردية باللون الأحمر. تظهر خريطة البيسلفيت التمثيلية هذه تحليلاً كمياً عالي الإنتاجية للميثيلة في عينة ما.

يمكن أن يؤدي استخدام تقنية sequenome epi typer إلى إنتاج طيف محدد يعتمد على وجود السيتوزينات الميثيلية، كما هو موضح في هذا المثال في الشكل 5 A. ومن ثم يمكن استقراء ملخص للنسب في العينة على شكل مخطط إيبيغرام في الشكل 5 B. يوضح هذا المثال النسبة المئوية لميثيلة DNA عند كل موقع CPG لأربعة خطوط خلوية مختلفة. وأخيراً، يمكن اشتقاق ملخص لمخطط الميثيلة في الشكل 5 C من الإيبيغرام بعد تطويره. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم فوق الجينات لاستكشاف ميثيلة DNA ودورها في الأمراض البشرية.