الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين تحليل مثيلة الحمض النووي لثنائي النوكليوتيدات CPG عن طريق التسلسل الجيني للحمض النووي المحول بالكبريتيت. يتم تحقيق ذلك عن طريق تغيير الطبيعة أولا ، الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، بحيث يمكن أن يحدث تفاعل تحويل ثنائي الكبريتيت. الخطوة الثانية هي تحويل جميع السيتوزينات غير الميثيلة في الحمض النووي الجيني إلى اليوراسيل عن طريق إزالة الكبريتات الثنائية.

يتضمن هذا التفاعل ثلاث مراحل. الأول هو كبريتات بقايا السيتوزين عن طريق إضافة كبريتيت ب إلى الرابطة المزدوجة الستة الخمسة. ثانيا ، ينتج عن إزالة الأمين الهيدروليكي للسيتوزين بواسطة مشتق الكبريتيت SSL بواسطة مشتق الكبريتيت ، وثالثا ، تؤدي إزالة مجموعة السلفونات عن طريق المعالجة القلوية إلى بقايا SSL.

بعد ذلك ، يتم تضخيم المنطقة المستهدفة بواسطة بادئات محددة لتحويل الكبريتيت ثنائي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الخطوة الأخيرة هي استنساخ وتسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لإعطاء دقة نيوكليوتيدات واحدة للمثيلة عبر جزيء الحمض النووي. في النهاية ، تظهر النتائج مثيلة الحمض النووي لثنائي النوكليوتيدات CPG في الحمض النووي الجيني من خلال استغلال الحساسية المتزايدة للسيتوكين مقابل خمسة ميثيل سيتوزين لإزالة أمينات ثنائي الكبريتات في ظل الظروف الحمضية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تحليل الدم الجنوبي ، هي أنها يمكن أن تسمح بحل النيوكليوتيدات المفردة لمثيلة د. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق ، مثل دور مثيلة الحمض النووي في الأمراض البشرية مثل السرطان. لتحضير عينات الحمض النووي لتحويل ثنائي الكبريتيت ، قم أولا باحتضان ميكروغرامين من الحمض النووي الجيني مع ثنائي الكبريتيت ، والمخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي ، والحجم الإجمالي 18 ميكرولتر لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

ثم قم بتغيير طبيعة الحمض النووي الجيني عن طريق إضافة ميكرولترين من هيدروكسيد الصوديوم ثلاثي المولار المحضر حديثا إلى تركيز نهائي يبلغ 0.3 مولار. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي ، تليها الحضانة عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين. في كتلة حرارية ، ضع الأنابيب على الفور على الجليد لمدة خمس دقائق ، وقم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 ثوان إلى 10 ، 000 Gs للتأكد من أن الحمض النووي موجود في الجزء السفلي من الأنبوب ، وعينات الحمض النووي المفسدة جاهزة الآن لإزالة أمينشن محاربة الخلايا البائية ، والتي سيتم عرضها بعد ذلك.

قبل تفاعلات إزالة الكبريتات وإزالة الأمين المائي ، قم بإعداد محاليل جديدة من 10 مللي مولار كينول وميتا الصوديوم المشبع بواسطة درجة الحموضة الكبريتية 5.0. نظرا لأن ميتا الصوديوم بواسطة الكبريتيت عبارة عن محلول مشبع ، فقد تظل الكتل الصغيرة غير مذابة. أضف ميتا الصوديوم بواسطة الكبريتيت 208 ميكرولتر والكينول 12 ميكرولتر إلى الحمض النووي المشوه 20 ميكرولتر في الحجم النهائي 240 ميكرولترا.

قم بتدوير الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثوان للتأكد من أن جميع القطرات في قاع الأنبوب. تراكب العينات بالزيت المعدني. احتضان العينات عند 55 درجة مئوية في حمام مائي لمدة أربع إلى 16 ساعة ، اعتمادا على كمية ونوعية الحمض النووي المراد تحويله.

من المهم أن يتم تحويل ثنائي الكبريتيت في الظلام لتجنب الأكسدة. في نهاية وقت الحضانة المناسب ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير للتأكد من أن كل السائل في قاع الأنبوب. ثم قم بإخراج محلول الحمض النووي بعناية من قاع الأنبوب دون امتصاص أي من الزيوت المعدنية.

للخطوات التالية ، يستخدم مختبرنا نظام تنظيف الحمض النووي لمعالج promega. أضف راتنج مليلتر واحد إلى عينات الحمض النووي ، واقلب الأنبوب للخلط ، ثم قم بماصة المحلول في حقنة متصلة بعمود تحلية المياه. أخيرا ، لإزالة أي أيونات حرة من كبريتيت ثنائي الكبريتيت ، قم بتمرير الحمض النووي المعالج بثنائي الكبريتيت عبر عمود التحلية والتألم إلى 50 ميكرولترا من ماء Milli Q.

الخطوة التالية هي إزالة علية ثنائي الكبريتيت من حلقة اليوراسيل عن طريق تحلية المياه. لتحقيق ذلك ، أضف 5.5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم الملي الطازج إلى كل عينة من الحمض النووي المعالجة بثنائي الكبريتيت للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.3 مولار. ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بالطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة ثم أضف ميكرولتر واحد من TRNA إلى كل عينة. قم بتحييد المحلول عن طريق إضافة أسيتات الأمونيوم إلى التركيز النهائي لثلاثة ضرس. بعد ذلك ، يترسب الإيثانول الحمض النووي.

يضاف الثلج البارد ، 100٪ الإيثانول 330 ميكرولتر ويخلط جيدا عن طريق الانعكاس. اتركيه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة إلى جهاز طرد مركزي طوال الليل عند 14،000 GS لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة جميع آثار المادة الطافية وجفف الحمض النووي المترسب بالهواء لمدة 20 دقيقة تقريبا.

بعد تجفيف الهواء, يكاد يكون من المستحيل رؤية الحبيبات إعادة تعليق حبيبات الحمض النووي في 50 ميكرولتر من 0.1 XTE أو ترك الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين تقريبا خلال هذا الوقت, في بعض الأحيان, دوامة الأنابيب لضمان إذابة الحمض النووي, متبوعا بجهاز طرد مركزي سريع. بمجرد إذابة الحمض النووي ، يمكن تخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة سنة إلى 10 سنوات ، اعتمادا على كمية ونوعية الحمض النووي أو استخدامه على الفور. بالنسبة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يعد تحسين التمهيدي هو أصعب جانب في هذا الإجراء.

لذلك ، يتم توفير الإرشادات التالية للمساعدة في ضمان نجاح تصميم التمهيدي. لتوضيح هذه الإرشادات ، تم تحويل التسلسل المستهدف عن طريق الكبريتيت بحيث يظهر السيتوزين المحول عند الكتابة على شكل Ts أزرق وتظهر مواقع CPG غير المحولة كبادئات cgs حمراء يجب أن يكون طولها من 24 إلى 30 زوجا أساسيا لضمان الخصوصية. يجب أن يكون للبادئات TM متوقع بالمثل أعلى من 50 درجة مئوية ولا تختلف بأكثر من درجة إلى درجتين مئويتين.

يجب أن تحتوي البادئات على قواعد متعددة من 25٪ C إلى T تقريبا لضمان خصوصية التحويل. يجب تجنب القاعدة النهائية التي يجب أن تكون الأطراف الأولية الثلاثة من C إلى T لضمان تضخيم ثنائي النوكليوتيدات المحولة D-N-A-C-P-G في التسلسل التمهيدي لتجنب التحيز المحتمل نحو القوالب الميثيلة غير الميثيلة أو غير المحولة. ومع ذلك ، إذا كان لا مفر منه ، فيجب استبدال السيتوزين في موقع CPG ب Y للمساعدة في ضمان تضخيم غير متحيز للحمض النووي المحول.

أخيرا ، قم بتصميم مجموعات أولية متداخلة أو شبه متداخلة لضمان خصوصية أو حساسية تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا لزم الأمر. تحضير مخاليط تفاعل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في 25 ميكرولتر من أجل التحسين. يحتوي كل تفاعل على بادئات DPS الجينومية المحولة من الكبريتيت ، وكلوريد المغنيسيوم ، وكلوريد البوتاسيوم ، وهيدروكلوريد البوتاسيوم ، ودرجة الحموضة 8.3 ، وبوليميراز anac لاختبار تحيز تضخيم المواد الميثيلية أو غير الميثيلية.

استخدم عينة تحكم محولة 50 50 غير ميثيل كامل ثنائي الكبريتيت لاختبار تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل النسبي مع تحويل ثنائي الكبريتيت. تقوم بادئات محددة ومزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري متدرج درجة الحرارة بضبط تفاعل التشغيل في تدرج زائد أو ناقص ثلاث درجات مئوية من TM للبرايمر عبر ثمانية إلى 10 أنابيب ، ودوامة الأنابيب وتدور لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق قبل وضعها في الدراجة الحرارية. يوضح هذا الشكل هلام agros مع ملف تعريف تضخيم PCR متدرج درجة الحرارة من خليط من 50٪ من الحمض النووي الميثيل وغير الميثيلي.

معالجة Amplicons والممرات المميزة ب T الممرات الثانية والخامسة والثامنة بإنزيم تقييد من شأنه أن يهضم فقط الحمض النووي الميثيل ، يجب أن تضخيم ظروف تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المثلى الميثيل وغير الميثيل بما يتناسب وبدون تحيز مما يؤدي إلى كمية متساوية من منتج PCR المقطوع وغير المقطوع كما هو موضح هنا. تكون ظروف التدوير الحراري المثلى للتضخيم غير المتحيز عند 55.6 درجة مئوية. يمكن تحليل التحويل الكامل للحمض النووي للكبريتات الثنائية عن طريق الهضم باستخدام إنزيم خاص بموقع السيتوزين والذي لن يهضم سوى ممرات الحمض النووي غير المحولة ثلاثة وستة وتاسعة.

يشار هنا إلى تحويل الحمض النووي الكامل للكبريتات الثنائية من خلال عدم وجود الحمض النووي المقطوع في جميع الممرات الثلاثة والممرات الثالثة والسادسة والتاسعة. تظهر مخططات التفكك في الوقت الفعلي نسبة متساوية من الخط البرتقالي الأحمر للحمض النووي الميثيل وغير الميثيل 50 50 مقارنة بتضخيم التحكم في الخط الوردي الميثيلي بالكامل m والخط الأخضر غير الميثيل للحمض النووي U ، والتي تنفصل عند 82.9 درجة مئوية و 86.9 درجة مئوية على التوالي. يشير هذا إلى عدم وجود تحيز تضخيم بناء على درجة الحرارة التي ستنفصل عندها الجزيئات المختلفة.

يمكن تصور شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة عن تضخيم العينات المعالجة بالكبريتات الثنائية عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الزراعي وتسلسلها. يظهر هنا مباشرة تتبع تسلسل من ثلاثة خطوط خلوية مختلفة مع مواقع CPG المميزة في خط الخلية الأصفر X يعرض مثيلة بنسبة 100٪ في جميع مواقع CPG الثلاثة ، حيث تظهر خطوط الخلايا Y و Z درجات متفاوتة من المثيلة كما يتضح من إشارات GA المتداخلة الموضحة هنا. الشكل الرابع أ هو تتبع تسلسل من ثلاثة خطوط خلوية مختلفة مع مواقع CPG مظللة باللون الأصفر.

بعد التسلسل المباشر للنسخ الفردية ، يمكن جدولة حالة مثيلة الجزيئات الفردية في خريطة ثنائي الكبريتيت. لتصور مثيلة عدم التجانس ، تظهر كثافة المثيلة في مواقع CPG الفردية باللون الأحمر. في هذه الخريطة التمثيلية ثنائية الكبريتيت ، تحليل المثيلة الكمي عالي الإنتاجية للعينة.

يمكن أن ينتج عن استخدام تقنية epi typer التكملة طيفا محددا يعتمد على وجود السيتوسينات الميثيلية ، كما هو موضح في هذا المثال الشكل خمسة أ.يمكن بعد ذلك استقراء ملخص النسب في العينة في شكل epigram الشكل خمسة B. يوضح هذا المثال النسبة المئوية لمثيلة الحمض النووي في كل موقع CPG لأربعة خطوط خلايا مختلفة. أخيرا ، يمكن اشتقاق ملخص مخطط المثيلة الشكل خمسة C من epigram بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق لاستكشاف مثيلة الحمض النووي ودورها في الأمراض البشرية.