تحليل شامل للحمض النووي باستخدام طريقة ميثيل-كبغ الملزمة القائمة على الالتقاط في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة التنميط العالمي للمثيلة وتحديد المناطق الغنية ب CpG الميثيل التفاضلي في مرضى ابيضاض الدم الليمفاوي المزمن باستخدام تسلسل الجيل التالي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق ، مثل تحديد الجينات المميزة المحتملة الخاصة ب CLL ، والتسبب في المرض ، والتشخيص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تغطية كاملة على مستوى الجينوم لمثيلة CpG بطريقة غير متحيزة ومستقلة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

للبدء ، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي المتوفرة تجاريا لعزل الحمض النووي الجيني من المريض وعينات الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي الطبيعية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد تحديد الحمض النووي الجيني كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتخفيف 5 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني من كل عينة ، إلى ما مجموعه 200 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت TE ، مما يعطي تركيزا نهائيا قدره 25 نانوغراما لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإجراء الصوتنة في أنابيب مصممة خصيصا ، باستخدام مكبر الصوت ، لما مجموعه 30 دورة من 30 ثانية و 30 ثانية.

بعد كل خمس دورات ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لجمع العينات إلى الأسفل. تحقق من نطاق صوتنة لجميع العينات باستخدام الرحلان الكهربائي للحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحضير حبات الستربتافيدين المغناطيسية ، أعد تعليقها أولا من أنبوب المخزون الذي توفره المجموعة.

قم بتحريك الخرزات برفق لأعلى ولأسفل للحصول على تعليق متجانس. لكل خمسة ميكروغرامات من عينة الحمض النووي المجزأة ، ضع 50 ميكرولترا من الخرزات في أنابيب منفصلة ونظيفة ومصنفة سعة 1.5 مل. أضف 50 ميكرولترا من مخزن غسيل الخرز 1X للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر.

ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة للسماح لجميع الخرزات المغناطيسية بالتركيز على الجدار الداخلي للأنبوب المواجه للمغناطيس. قم بإزالة السائل دون لمس الخرزات باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنابيب من الحامل المغناطيسي ، وأضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الخرزة 1X ، واخلط الخرزات برفق باستخدام ماصة.

بعد تكرار هذه الخطوات أربع مرات على الأقل لجميع العينات ، قم أخيرا بتعليق العينات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الخرزة 1X. احتفظ بالعينات على الجليد. لربط بروتين MBD-biotin بالخرز المغسول ، أضف أولا 35 ميكرولترا من البروتين لفصل الأنابيب ورفع الحجم الإجمالي إلى 250 ميكرولتر باستخدام مخزن غسيل الخرزة 1X.

أضف 250 ميكرولترا من بروتين MBD المخفف إلى 250 ميكرولترا من الخرز المغسول واتركها في حالة دوران من طرف إلى طرف في درجة حرارة الغرفة. بعد خلط الخرزات في البروتين لمدة ساعة واحدة ، اغسل حبات الستربتافيدين المغناطيسية المرتبطة بالبروتين عن طريق وضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة السائل دون لمس الخرزات باستخدام ماصة.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من مخزن غسيل الخرز 1X وضع الأنابيب على خلاط دوران لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين قبل إعادة تعليق حبات MBD-biotin المغسولة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الخرزة 1X ، مما يجعل الخرزات جاهزة لالتقاط الحمض النووي الميثيلي. في أنبوب نظيف خال من DNase سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 100 ميكرولتر من مخزن غسيل حبة المليلتر و 180 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المجزأ.

ارفع الحجم النهائي إلى 500 ميكرولتر باستخدام ماء خال من DNase. أضف 380 ميكرولترا من الماء الخالي من DNase إلى 20 لترا المتبقية من الحمض النووي الجيني المجزأ. قم بتجميد العينات لمعالجتها لاحقا واستخدامها كعناصر تحكم في إدخال الحمض النووي.

ضع الأنابيب التي تحتوي على حبات MBD-biotin المغسولة على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة السائل دون إزعاج الخرز. ثم أضف 500 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المجزأ المخفف في مخزن غسيل الخرز. أغلق جميع الأنابيب بإحكام بغشاء البارافين واتركها طوال الليل عند 4 درجات مئوية على حامل دوران من طرف إلى طرف من 8 إلى 10 دورات في الدقيقة.

بعد تفاعل ربط حبة الحمض النووي و MBD ، ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لتركيز جميع الخرزات على الجدار الداخلي للأنبوب. قم بإزالة السائل الطافي باستخدام ماصة دون لمس الخرز، واحفظ جزء عينة الحمض النووي غير المرتبط هذا على الجليد. ثم أضف 200 ميكرولتر من مخزن غسيل الخرزة 1X إلى الخرزات وضع الأنابيب على الحامل الدوار لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة السائل باستخدام الحامل المغناطيسي ، كرر الغسيل مرتين أخريين لإزالة الحمض النووي غير المرتبط المتبقي. بعد الغسيل النهائي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت عالي المحلول للملح الموجود في المجموعة لتصفية الحمض النووي. ثم ضع الأنابيب على الحامل الدوار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، ضعها على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة واستخدم ماصة لنقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد نظيف سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول الشطف عالي الملح إلى الخرز ، وكرر الشطف عن طريق تدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة إضافية. أضف اللوت الثاني إلى نفس الأنبوب الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من المحلول الأول.

لترسيب الحمض النووي ، أضف ميكرولتر واحد من الجليكوجين ، و 40 ميكرولترا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، ودرجة الحموضة 5.2 ، و 800 ميكرولتر من الإيثانول المطلق المثلج إلى 400 ميكرولتر من الحمض النووي المملح. أضف أيضا الكواشف إلى 400 ميكرولتر المجمدة مسبقا من عينات التحكم في الحمض النووي المدخلة. امزج الأنابيب جيدا عن طريق الدوامة قبل احتضانها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12،000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. ثم أضف 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول ودوامة الأنابيب.

بعد الطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى باستخدام نفس الظروف ولكن لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة بعناية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة الإيثانول المتبقي تماما باستخدام طرف الماصة. جفف الحبيبات بالهواء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أخيرا ، أضف 10 ميكرولترات من الماء الخالي من DNase إلى حبيبات الحمض النووي قبل الشروع في القياس الكمي للحمض النووي الميثيل ، وتسلسل MBD ، والتحليل كما هو موضح في بروتوكول النص. حدد التحليل العديد من المناطق المفرطة ونقص الميثيل تفاضليا المخصبة في عينات CLL مقارنة بالضوابط العادية. تم تعيين هذه المناطق الميثيلية تفاضليا إلى فئات مختلفة من جينات ترميز البروتين وغير المشفرة.

أخيرا ، أظهر تحليل البيانات تداخلا كبيرا بين المناطق الميثيلية التفاضلية المرتبطة ب CLL التي تم الحصول عليها من مقارنتين طبيعيتين مختلفتين. هنا ، تم التحقق من صحة جميع مواقع CpG الموجودة في المناطق المستهدفة لجينين ميثيليتين تفاضليا في عدد كبير من عينات CLL باستخدام pyrosequencing. يتم توضيح النطاق الأمثل للصوتنة المطلوبة لهذه الطريقة هنا.

هذه المجموعة من الحمض النووي المجزأ مثالية وأكثر ملاءمة لأغراض تسلسل الجيل التالي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، فإن العوامل الحاسمة التي تؤثر على استعادة الحمض النووي النهائي هي جودة وكمية الحمض النووي المدخل المستخدم ونطاق الحمض النووي المجزأ بعد الصوتنة.

قررنا استخدام هذه الطريقة لأنها أول دراسة مثيلة عالمية ل CLL تعتمد على الترسيب المناعي لإثراء الحمض النووي الميثيلي الذي يغطي جميع المناطق الميثيلية عبر الجينوم. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التشخيص أو العلاج لأن جينات التوقيع الميثيلية التفاضلية المحددة يمكن أن تكون بمثابة مؤشرات حيوية طبيعية عالمية وأهداف جينية للعلاج. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام الحمض النووي الميثيلي المخصب في تطبيقات المصب الأخرى مثل التهجين أو القيام بالمصفوفات الدقيقة لمقارنة المعادن بسهولة بين عينتين أو كيانات مرضية باستخدام مجموعة ثابتة من مواقع CpG الموجودة على المصفوفات.

أخيرا ، هذه تقنية فعالة من حيث التكلفة لتحليل عدد كبير من عينات المرضى للتسلسلات الميثيلية عبر الجينوم ، بما في ذلك التسلسلات المشروحة التي تمتد عبر جينات ترميز البروتين بالإضافة إلى التسلسلات غير المشروحة التي تمتد عبر العناصر المتكررة والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر.