في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتقييم قابلية المضادات الحيوية لعزلات مزرعة الدم في وقت أقل من الطرق التقليدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد عزل مزرعة الدم أولا. باستخدام اختبار جديد 16 ثانية ريبوسومي, DNA MultiPro PCR.

ثم يتم تحضين العزل بلوحة من المضادات الحيوية لمدة ست ساعات. الخطوة التالية هي تحديد النمو أو النمو في تثبيط العزلة في وجود المضاد الحيوي باستخدام مقايسة ريبوسومية كمية 16 ثانية D-N-A-P-C-R. في النهاية ، تظهر النتائج أنه يمكن الحصول على تحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية لعزل مزرعة الدم بسرعة أكبر من خلال هذا المزيج من الثقافة و PCR.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تلك التي تستخدم أنظمة phoenix أو IIC الآلية ، هي أنه لا توجد حالة استزراع سابقة مطلوبة ، وأن نتائج تحديد الهوية واختبار الحساسية للمضادات الحيوية يمكن أن تكون متاحة في نفس اليوم. سيوضح الإجراء فاندي هانسون وطلاب الدكتوراه من مختبرنا 100 ميكرولتر من مزرعة الدم الإيجابية للنمو الميكروبي في أنبوب تفاعل يحتوي على 900 ميكرولتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 13 ، 400 مرة G لمدة خمس دقائق لتكوير البكتيريا بعد الطرد المركزي.

ريس ، الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع المعادن. قم بتثبيت العينة عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر. بمجرد أن تصبح جميع العينات جاهزة ، قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتضخيم الحمض النووي الريبوزومي المحدد 16 ثانية من البكتيريا ذات الأهمية.

استخدم الماء منزوع المعادن لضبط الأحجام على 20 ميكرولتر لكل تفاعل. Aliquot 20 ميكرولتر من مزيج PCR لكل بئر في لوحة PCR 96 بئر. ثم أضف خمسة ميكرولترات من العينة إلى كل بئر وأغلق لوحة PCR.

بعد ذلك ، قم بتشغيل PCR على نظام A BI Prism 7 ، 900 HT Real-time PCR لتحليل النتائج بمجرد اكتمال PCR ، استخدم أولا علامة تبويب إعدادات التحليل لضبط تحليل التصوير المقطعي المحوسب على 0.1. ثم قم بتضييق نطاق تكوينات الخط الأساسي لبدء الدورة السادسة وإنهاء الدورة 15. سجل قيمة التصوير المقطعي المحوسب لكل عينة.

يمكن تعيين القيمة النهائية لاعتبار نتيجة PCR موجبة بشكل عام على قيمة CT 35. في هذا المثال ، يظهر ملف تعريف مزرعة الدم المصابة بالإشريكية القولونية في مزيجين من التفاعل. تم تضمين بادئات الحمض النووي الريبوزومي العالمي 16 ثانية وولدت منحنيين تضخيم من CT 25.2 و 25.95.

منحنى التضخيم الثالث مشتق من المسبار الخاص بالقولون. لم تولد مجسات محددة أخرى إشارات يمكن اكتشافها. بمجرد تحديد العامل الممرض ، يمكن إجراء اختبار المضادات الحيوية.

ابدأ بنقل خمسة ملليلتر من المرق من مزرعة الدم الإيجابية إلى أنبوب فاصل المصل. الطرد المركزي العينة عند 2000 مرة G لمدة 10 دقائق بعد الطرد المركزي ، وتخلص من عامل supan من الأنبوب. ثم باستخدام قطعة قطن معقمة ، انقل البكتيريا من طبقة هلام الأنبوب إلى 0.9٪ كلوريد الصوديوم حتى يتم الحصول على محلول بتعكر بمعيار 0.5 ماكفارلاند.

هذا يتوافق مع حوالي 1.5 في 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة الثماني لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف التعليق بتركيز مزدوج مولر هينتون. مرقان للحصول على تركيز حوالي خمسة في 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة الخمس لكل مليلتر.

Aliquot 50 ميكرولتر لكل بئر من التعليق في لوحة ميكروتيتر تحتوي بالفعل على 50 ميكرولترا لكل بئر من مجموعة مختارة من المضادات الحيوية. تأكد من تضمين ضوابط نمو إيجابية لكل عينة باستخدام آبار بها ماء بدلا من المضادات الحيوية. غطي الطبق عند الانتهاء.

ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات للسماح بنمو البكتيريا. تأكد من تخزين كمية من المعلق البكتيري عند أربع درجات مئوية كعنصر تحكم سلبي في النمو. بعد الحضانة لمدة ست ساعات ، قم بنقل محتوى كل بئر وعينة التحكم السلبية إلى أنابيب معقمة منفصلة.

بعد خمس دقائق من الطرد المركزي في 16,000 مرة. G ، قم بإزالة 80 ميكرولتر من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 80 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع المعادن. خفف العينات من واحد إلى 10 في الماء قبل استخدامها لمدة 16 ثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي للحمض النووي.

قم بإعداد مزيج PCR باستخدام IQ cyber green super mix و 16 s ribosomal DNA primers و aliquot. 20 ميكرولتر لكل بئر في لوحة PCR 96 بئر. ثم أضف خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى الآبار وأغلق اللوحة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل PCR لتحليل النتائج. أولا ، احسب قيمة CT النهائية. بشكل عام ، يساوي التصوير المقطعي المحوسب القطع التصوير المقطعي المحوسب للتحكم الإيجابي في النمو بالإضافة إلى 0.5 ضعف CT للتحكم في النمو السلبي مطروحا منه CT للتحكم في النمو.

ومع ذلك ، بالنسبة للبيبيراسيلين بيبيراسيلين مع تازوباكتام و CEF دازادي في قضبان سالبة الجرام وكذلك للأموكسيسيلين والأوكساسيلين والتريميثوبريم مع السلفاميثوكسازول في المكورات العنقودية الذهبية أو من الأموكسيسيلين. في المكورات المعوية SPP ، يجب تقليل عامل الضرب 0.5 إلى 0.25. يمكن تحديد قابلية أو مقاومة السلالات في كل عينة من خلال مقارنة التصوير المقطعي المحوسب للعينة بالتصوير المقطعي المحوسب.

قيمة التصوير المقطعي المحوسب فوق القطع إلى القابلية للتأثر بينما يشير التصوير المقطعي المحوسب أسفل القطع إلى المقاومة. فيما يلي مثال على مؤامرة تضخيم الحساسية للمضادات الحيوية. تم اختبار سلالة الإشريكية القولونية التي تم تحديدها سابقا للتأكد من الحساسية للعديد من المضادات الحيوية التي يمثل كل منها منحنى منفصل.

العينات ذات القيمة المقطعية المنخفضة هي العينات التي حدث فيها نمو في وجود مضاد حيوي يشير إلى مقاومة المضاد الحيوي المختبر. على العكس من ذلك ، تمثل قيمة التصوير المقطعي المحوسب العالية عينة لم يحدث فيها نمو مما يشير إلى القابلية للإصابة بالمضاد الحيوي المختبر بمجرد إتقانه. يمكن إجراء هذه التقنية في تسع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.