في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتقييم الحساسية للمضادات الحيوية لعزلات مزارع الدم في وقت أقل مما تتطلبه الطرق التقليدية. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحديد عزلة مزرعة الدم أولاً، باستخدام مقايسة MultiPro PCR المبتكرة للحمض النووي الريبوزومي 16 s.

بعد ذلك، يتم تحضين العزلة مع مجموعة من المضادات الحيوية لمدة ست ساعات. وتتمثل الخطوة التالية في تحديد نمو العزلة أو تثبيط نموها في وجود المضاد الحيوي باستخدام مقايسة 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R الكمية. وفي النهاية، تظهر النتائج أن تحديد هوية عزلة مستنبت الدم واختبار حساسيتها للمضادات الحيوية يمكن الحصول عليهما بشكل أسرع من خلال هذا الدمج بين الاستنبات وPCR.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تلك التي تستخدم أنظمة phoenix أو IIC المؤتمتة، في عدم اشتراط حالة استنبات مسبقة، وإمكانية الحصول على نتائج التعريف واختبار الحساسية للمضادات الحيوية في اليوم نفسه. سيقوم كل من Vandy Hanson و GID، وهما طالبان في مرحلة الدكتوراه من مختبرنا، بتوضيح الإجراء. خفف 100 µL من مزرعة دم إيجابية للنمو الميكروبي في أنبوب تفاعل يحتوي على 900 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9%. ثم قم بطرد العينة مركزياً عند 13,400 ×g لمدة خمس دقائق لترسيب البكتيريا بعد عملية الطرد المركزي.

يا ريز، قم بتعليق الراسب في 100 microliters من الماء المقطر المعقم. واحفظ العينة عند درجة حرارة أربع degrees Celsius حتى حين استخدامها. وبمجرد تجهيز جميع العينات، قم بتحضير خلائط تفاعل PCR في الوقت الحقيقي لتضخيم 16 s ribosomal DNA النوعي من البكتيريا المستهدفة.

استخدم الماء منزوع المعادن لضبط الأحجام لتصل إلى 20 µL لكل تفاعل. قم بتوزيع 20 µL من خليط PCR في كل بئر من آبار لوحة PCR ذات الـ 96 بئرًا. بعد ذلك، أضف خمسة µL من العينة إلى كل بئر وأغلق لوحة PCR بإحكام.

بعد ذلك، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام نظام الـ PCR في الوقت الحقيقي A BI Prism 7, 900 HT، ولتحليل النتائج بمجرد اكتمال التفاعل، استخدم أولاً علامة تبويب إعدادات التحليل لضبط تحليل CT على 0.1. ثم قم بتضييق تكوينات خط الأساس لتبدأ من الدورة السادسة وتنتهي عند الدورة 15. سجل قيمة CT لكل عينة.

يمكن عموماً تحديد قيمة القطع لاعتبار نتيجة PCR إيجابية عند قيمة CT تبلغ 35. في هذا المثال، يظهر ملف التعريف التعريفي لمزرعة دم مصابة بـ e coli في خليطين من تفاعلات الـ reaction mixes. تم تضمين بادئات Universal 16 s ribosomal DNA والتي أنتجت منحنيين تضخيم بقيم CT بلغت 25.2 و 25.95.

يتم اشتقاق منحنى التضخيم الثالث من المسبار الخاص بـ Coli. ولم تولد المسابير النوعية الأخرى إشارات يمكن اكتشافها. وبمجرد تحديد الممرض، يمكن إجراء اختبار المضادات الحيوية.

ابدأ بنقل خمسة ملليلتر من المرق من مزرعة دم إيجابية إلى أنبوب فصل المصل. قم بطرد العينة مركزياً عند 2000 ×g لمدة 10 دقائق، وبعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي من الأنبوب. ثم باستخدام مسحة قطنية معقمة، انقل البكتيريا من الطبقة الهلامية للأنبوب إلى 0.9% sodium chloride حتى يتم الحصول على محلول بعكارة تعادل معيار 0.5 McFarland.

يعادل هذا حوالي 1.5 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر. بعد ذلك، يتم تخفيف المعلق في مرق Muller Hinton بتركيز مضاعف للحصول على تركيز يقارب 5 × 10⁵ وحدة تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر.

قم بتوزيع 50 µL من المعلق في كل بئر من آبار صفيحة معايرة دقيقة تحتوي مسبقاً على 50 µL من مجموعة مختارة من المضادات الحيوية في كل بئر. تأكد من إدراج ضوابط نمو إيجابية لكل عينة باستخدام آبار تحتوي على الماء بدلاً من المضادات الحيوية. قم بتغطية الصفيحة عند الانتهاء.

ثم يتم تحضين الطبق عند 37 °C لمدة ست ساعات للسماح بالنمو البكتيري. تأكد من تخزين جزء من المعلق البكتيري عند 4 °C كعينة ضابطة لعدم النمو. بعد تحضين لمدة ست ساعات، يتم نقل محتوى كل بئر وعينة الضابطة السالبة إلى أنابيب معقمة منفصلة.

بعد إجراء عملية طرد مركزي لمدة خمس دقائق بسرعة 16,000 ×g، قم بإزالة 80 µL من السائل الطافي وأعد تعليق الرواسب في 80 µL من الماء المقطر المعقم. قم بتخفيف العينات بنسبة 1:10 في الماء قبل استخدامها في تحليل real-time PCR للحمض النووي الريبوزي 16s rDNA.

قم بتحضير خليط PCR باستخدام IQ cyber green super mix وبادئات 16 s ribosomal DNA، ثم وزع 20 µL في كل بئر من بئر لوحة PCR ذات 96 بئرًا. بعد ذلك، أضف 5 µL من كل عينة إلى الآبار وأغلق اللوحة بإحكام.

بعد ذلك، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحليل النتائج. أولاً، احسب قيمة CT الحدية. وبشكل عام، تساوي قيمة CT الحدية قيمة CT لضابط النمو الموجب زائد 0.5 مضروبة في قيمة CT لضابط النمو السالب ناقص قيمة CT لضابط النمو.

ومع ذلك، بالنسبة لـ piperacillin مع tazobactam و CEF dazadi في العصويات سالبة الجرام، وكذلك بالنسبة لـ amoxicillin و oxacillin و trimethoprim مع sulfamethoxazole في staphylococcus aureus أو من amoxicillin في enterococcus SPP، يجب تخفيض عامل الضرب من 0.5 إلى 0.25. ويمكن تحديد مدى حساسية أو مقاومة السلالات في كل عينة من خلال مقارنة CT الخاصة بالعينة بـ cutoff ct.

تشير قيمة CT التي تزيد عن الحد الفاصل إلى القابلية للتأثر، بينما تشير القيمة التي تقل عن الحد الفاصل إلى المقاومة. إليك مثال على مخطط تضخيم للقابلية للتأثر بالمضادات الحيوية. لقد تم اختبار سلالة e coli التي تم تحديدها سابقاً لقياس مدى حساسيتها تجاه عدة مضادات حيوية، حيث يمثل كل منها منحنى منفصل.

تعتبر العينات ذات قيمة CT منخفضة عينات حدث فيها نمو في وجود مضاد حيوي، مما يشير إلى وجود مقاومة للمضاد الحيوي المختبر. وعلى العكس من ذلك، تمثل قيمة CT المرتفعة عينة لم يحدث فيها أي نمو، مما يشير إلى الحساسية تجاه المضاد الحيوي المختبر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون تسع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.