الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام
سبتمبر 16, 2011
قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.
لاختبار التفاعل بين بروتينين ، يجب استنساخ الجينين المعنيين في BF ونواقل باستخدام تقنية شوق البوابة. يتم تحويل هذه التركيبات إلى aerium GV 3 1 0 1. سيتم خلط المزارع البكتيرية GV 3 1 0 1 التي تحتوي على البناء والتسلل إلى الأوراق.
إذا تفاعل البروتينان المرشحان مع بعضهما البعض ، فيمكن ملاحظة إشارة YFP باستخدام بؤرة النتيجة المكسيك. الغرض الرئيسي من تقنية BFC هو اختبار التفاعل بين بروتينين. في vavo ، أنشأنا سلسلة من BFC المتوافقة مع البوابة و IS ، وهما متجهان هجينان يزودان الباحثين بأدوات سهلة الاستخدام لإجراء فحصين هجينين من BFC و ISTO.
في هذا الفيديو ، سنوضح سهولة استخدام نظام BFC الخاص بنا. لاختبار البروتين ، تتجاوز تفاعلات البروتين بطريقة غير قابلة للتعبير عن النظام. تحتاج أولا إلى تحضير GV 3 1 0 1 الثقافة البكتيرية.
تحتاج إلى اختيار مستعمرة واحدة من طبقك وتلقيح خمسة ذكور من وسط YEB بالمضادات الحيوية المناسبة. ثم تحتاج إلى هز هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 28 درجة. السرعة 200 شوط في الدقيقة.
يجب أن تكون الثقافات البكتيرية جاهزة في صباح اليوم التالي. تأكد من نمو البكتيريا D. أخرج الثقافات من الحاضنة وانقل ذكرا واحدا من كل مزرعة إلى أنبوب طرد مركزي معقم 1.5 ذكر.
ضع أنابيب أجهزة الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي سطح المكتب. قم بتدوير البكتيريا عند 1000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من الشنك. ثم شاهد القضيب بإضافة وجبة واحدة من وسط التسلل وإعادة التقييم حسب الملاعبة عدة مرات.
كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين. هذا مهم لأنه يساعد على إزالة أثر المضادات الحيوية في الوسط البكتيري ، مما يجعلك تزرع الأختام بعد التسلل. بعد الغسيل النهائي ، يعلق resus البليت في 0.5 متوسط تسلل ذكر يدين 600 من هذا البكتيريا المعلقة باستخدام مقياس ضوئي طيفي باستخدام وسيط التسلل كتحكم في البنك.
بعد قياس OD ، تحتاج إلى ضبط OD باستخدام وسيط التسلل. وينبغي أن يكون التوزيع التشغيلي النهائي بين واحد و2.1. يجب عليك تحضير جميع المعلقات البكتيرية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
انقل كمية متساوية من المعلقات البكتيرية المقابلة للبروتينين المرشحين وخلطهما في أنبوب ذكر جديد 1.5 يرتبط خليط البكتيريا السالبة الآن بالتسلل. قم بإعداد جميع المجموعات ولا تنس تضمين عنصر تحكم سلبي. يجب عليك استخدام رمز من خمسة إلى ستة أسابيع وأفضل طريقة للتسلل.
يمكنك إزالة النباتات من غرفة النمو ووضعها في الليل لمدة ساعة قبل التسلل لفتح هجوم العاصفة. هذا سوف يساعد في عملية التسلل. ارسم حوالي 100 ميكرولتر من البكتيريا العالقة Resus.
امزج بالقرب من حقنة طرف منزلقة واحدة بدون إبرة. ضع طرف المحقنة على الجانب السفلي من الورقة. ادعم الجانب العلوي من الركبة بإصبعك.
بشكل عام اضغط على المكبس. يجب أن تكون قادرا على رؤية السائل ينتشر من خلال الورقة حتى الآن تشعر أن مساحات الهواء الرقيقة بعد التسلل تمكن الهواء المتسلل باستخدام قلم علامة. خلاف ذلك ، بعد يومين ، لن تتمكن من التعرف على A المتسلل إذا كنت بحاجة إلى التسلل بمزيج بكتيري مختلف ، فتأكد من رش قفازك بنسبة 50٪ من الإيثانول أو تغيير قفازات G بين عمليات التسلل.
حاول ترك مسافة ضلع متر واحد بين عمليات التسلل لمنع التلوث المتبادل. يجب مراقبة إشارات PFA كل 24 ساعة من التسلل حتى خمسة أيام. يمكنك استخدام اثنين من الأكمام غطاء بأحجام مختلفة لحمل العينة.
أولا ، ضع قطرة واحدة من الماء الصغير على غلاف غطاء الشق. ثم قطع قطعة صغيرة من أنسجة السكين داخل المنطقة المخللة. حاول تجنب الغثيان الوريد في العينة.
ضع منديل السكين المقطوع في الماء على الشريحة أسفل التعيين ، قم بتغطيته باستخدام غلاف تيار أصغر واضغط برفق. الآن يمكن ملاحظة العينة تحت نطاق المكسيك. هنا نستخدم NACA T CSS P اثنين من المكسيك متحدة البؤر لتصور إشارة BIFC.
حتى الرائحة العادية المكسيك يمكن استخدامها. يوفر البؤر المتحد صورا أفضل ويكتشف الإشارات الضعيفة. يمكنك استخدام معلمة YFP للكشف عن إشارات VFC في نظام NCAs P two هذا.
يمكنك ببساطة النقر نقرا مزدوجا فوق هذا الإعداد المسبق ل YFP هنا ، والذي سيقوم تلقائيا بتشغيل الإثارة وتعيين نطاق اكتشاف الانبعاثات. إذا كنت تستخدم نظاما مختلفا ، فيرجى الرجوع إلى الدليل لتعيين المعلمات بشكل صحيح. نأمل أنه بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء BFCE لاختبار تفاعلات بروتين البروتين باستخدام نظام تعبير unbe MI Transcend.
يمكنك أيضا تطبيق هذا الإجراء على نباتات التبغ والزراعة الوراثية. تحتوي متجهات BFC الخاصة بنا أيضا على علامة HA وعلامة على التوالي، بحيث يمكنك أيضا إجراء عنوان IP مشترك للتحقق من صحة التفاعلات إذا لزم الأمر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنية جديدة لاختبار تفاعلات البروتين-البروتين في النباتات باستخدام نهج البروتين الفلوري الأصفر المنقسم (YFP). من خلال استنساخ شظايا YFP في الإطار مع جينات الاهتمام، يمكن للباحثين ملاحظة إعادة تكوين YFP، مما يشير إلى تفاعلات البروتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا النبات
- تفاعلات البروتين
- تقنيات البروتين الفلوري
الخلفية
- فهم تفاعلات البروتين أمر بالغ الأهمية لتوضيح العمليات البيولوجية.
- قد لا تكون الطرق التقليدية مناسبة لأنظمة النبات.
- تتيح تقنية YFP المنقسمة التصور في الوقت الحقيقي للتفاعلات.
- يسهل استنساخ Gateway إنشاء البروتينات المصهورة.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة فعالة لدراسة تفاعلات البروتين في النباتات.
- تزويد الباحثين بأدوات لإجراء مقايسات الهجين المزدوج BFC وISTO.
- تعزيز فهم وظائف البروتين في بيولوجيا النبات.
الطرق المستخدمة
- استنساخ شظايا YFP في ناقلات متوافقة مع Gateway.
- تحويل البنى إلى Agrobacterium GV3101.
- تغلغل مشترك للثقافات البكتيرية في أوراق النبات.
- مراقبة إشارة YFP باستخدام الميكروسكوب لتأكيد التفاعلات.
النتائج الرئيسية
- تشير إعادة تكوين الإشارة YFP الناجحة إلى تفاعلات البروتين.
- تظهر فعالية تقنية BFC في أنظمة النبات.
- توفير أدوات سهلة الاستخدام للباحثين.
- التحقق من صحة الطريقة من خلال أزواج البروتين المختلفة.
الاستنتاجات
- تعد تقنية YFP المنقسمة أداة قيّمة لدراسة تفاعلات البروتين في النباتات.
- يمكن لهذه الطريقة تسهيل المزيد من الأبحاث في بيولوجيا النبات.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية استكشاف شبكات البروتين المعقدة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
