الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.

لاختبار التفاعل بين بروتينين ، يجب استنساخ الجينين المعنيين في BF ونواقل باستخدام تقنية شوق البوابة. يتم تحويل هذه التركيبات إلى aerium GV 3 1 0 1. سيتم خلط المزارع البكتيرية GV 3 1 0 1 التي تحتوي على البناء والتسلل إلى الأوراق.

إذا تفاعل البروتينان المرشحان مع بعضهما البعض ، فيمكن ملاحظة إشارة YFP باستخدام بؤرة النتيجة المكسيك. الغرض الرئيسي من تقنية BFC هو اختبار التفاعل بين بروتينين. في vavo ، أنشأنا سلسلة من BFC المتوافقة مع البوابة و IS ، وهما متجهان هجينان يزودان الباحثين بأدوات سهلة الاستخدام لإجراء فحصين هجينين من BFC و ISTO.

في هذا الفيديو ، سنوضح سهولة استخدام نظام BFC الخاص بنا. لاختبار البروتين ، تتجاوز تفاعلات البروتين بطريقة غير قابلة للتعبير عن النظام. تحتاج أولا إلى تحضير GV 3 1 0 1 الثقافة البكتيرية.

تحتاج إلى اختيار مستعمرة واحدة من طبقك وتلقيح خمسة ذكور من وسط YEB بالمضادات الحيوية المناسبة. ثم تحتاج إلى هز هذه الثقافات بين عشية وضحاها عند 28 درجة. السرعة 200 شوط في الدقيقة.

يجب أن تكون الثقافات البكتيرية جاهزة في صباح اليوم التالي. تأكد من نمو البكتيريا D. أخرج الثقافات من الحاضنة وانقل ذكرا واحدا من كل مزرعة إلى أنبوب طرد مركزي معقم 1.5 ذكر.

ضع أنابيب أجهزة الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي سطح المكتب. قم بتدوير البكتيريا عند 1000 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من الشنك. ثم شاهد القضيب بإضافة وجبة واحدة من وسط التسلل وإعادة التقييم حسب الملاعبة عدة مرات.

كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين. هذا مهم لأنه يساعد على إزالة أثر المضادات الحيوية في الوسط البكتيري ، مما يجعلك تزرع الأختام بعد التسلل. بعد الغسيل النهائي ، يعلق resus البليت في 0.5 متوسط تسلل ذكر يدين 600 من هذا البكتيريا المعلقة باستخدام مقياس ضوئي طيفي باستخدام وسيط التسلل كتحكم في البنك.

بعد قياس OD ، تحتاج إلى ضبط OD باستخدام وسيط التسلل. وينبغي أن يكون التوزيع التشغيلي النهائي بين واحد و2.1. يجب عليك تحضير جميع المعلقات البكتيرية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

انقل كمية متساوية من المعلقات البكتيرية المقابلة للبروتينين المرشحين وخلطهما في أنبوب ذكر جديد 1.5 يرتبط خليط البكتيريا السالبة الآن بالتسلل. قم بإعداد جميع المجموعات ولا تنس تضمين عنصر تحكم سلبي. يجب عليك استخدام رمز من خمسة إلى ستة أسابيع وأفضل طريقة للتسلل.

يمكنك إزالة النباتات من غرفة النمو ووضعها في الليل لمدة ساعة قبل التسلل لفتح هجوم العاصفة. هذا سوف يساعد في عملية التسلل. ارسم حوالي 100 ميكرولتر من البكتيريا العالقة Resus.

امزج بالقرب من حقنة طرف منزلقة واحدة بدون إبرة. ضع طرف المحقنة على الجانب السفلي من الورقة. ادعم الجانب العلوي من الركبة بإصبعك.

بشكل عام اضغط على المكبس. يجب أن تكون قادرا على رؤية السائل ينتشر من خلال الورقة حتى الآن تشعر أن مساحات الهواء الرقيقة بعد التسلل تمكن الهواء المتسلل باستخدام قلم علامة. خلاف ذلك ، بعد يومين ، لن تتمكن من التعرف على A المتسلل إذا كنت بحاجة إلى التسلل بمزيج بكتيري مختلف ، فتأكد من رش قفازك بنسبة 50٪ من الإيثانول أو تغيير قفازات G بين عمليات التسلل.

حاول ترك مسافة ضلع متر واحد بين عمليات التسلل لمنع التلوث المتبادل. يجب مراقبة إشارات PFA كل 24 ساعة من التسلل حتى خمسة أيام. يمكنك استخدام اثنين من الأكمام غطاء بأحجام مختلفة لحمل العينة.

أولا ، ضع قطرة واحدة من الماء الصغير على غلاف غطاء الشق. ثم قطع قطعة صغيرة من أنسجة السكين داخل المنطقة المخللة. حاول تجنب الغثيان الوريد في العينة.

ضع منديل السكين المقطوع في الماء على الشريحة أسفل التعيين ، قم بتغطيته باستخدام غلاف تيار أصغر واضغط برفق. الآن يمكن ملاحظة العينة تحت نطاق المكسيك. هنا نستخدم NACA T CSS P اثنين من المكسيك متحدة البؤر لتصور إشارة BIFC.

حتى الرائحة العادية المكسيك يمكن استخدامها. يوفر البؤر المتحد صورا أفضل ويكتشف الإشارات الضعيفة. يمكنك استخدام معلمة YFP للكشف عن إشارات VFC في نظام NCAs P two هذا.

يمكنك ببساطة النقر نقرا مزدوجا فوق هذا الإعداد المسبق ل YFP هنا ، والذي سيقوم تلقائيا بتشغيل الإثارة وتعيين نطاق اكتشاف الانبعاثات. إذا كنت تستخدم نظاما مختلفا ، فيرجى الرجوع إلى الدليل لتعيين المعلمات بشكل صحيح. نأمل أنه بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء BFCE لاختبار تفاعلات بروتين البروتين باستخدام نظام تعبير unbe MI Transcend.

يمكنك أيضا تطبيق هذا الإجراء على نباتات التبغ والزراعة الوراثية. تحتوي متجهات BFC الخاصة بنا أيضا على علامة HA وعلامة على التوالي، بحيث يمكنك أيضا إجراء عنوان IP مشترك للتحقق من صحة التفاعلات إذا لزم الأمر.