الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

لاختبار التفاعل بين بروتينين، يجب استنساخ الجينين المستهدفين في ناقلات BF الخاصة بنا باستخدام تقنية استنساخ gateway. يتم تحويل هذه النواتج إلى سلالة aerium GV 3 1 0 1. بعد ذلك، يتم خلط المزارع البكتيرية GV 3 1 0 1 التي تحتوي على كل ناتج وإجراء عملية تسلل مشترك (co-infiltration) في الأوراق.

إذا تفاعلت البروتينات المرشحة مع بعضها البعض، يمكن ملاحظة إشارة YFP باستخدام مجهر بؤري. الغرض الأساسي من تقنية BFC هو اختبار التفاعل بين بروتينين. في vavo، قمنا بإنشاء سلسلة من ناقلات BFC و IS two hybrid المتوافقة مع gateway، والتي توفر للباحثين أدوات سهلة الاستخدام لإجراء كل من مقايسات BFC و ISTO two hybrid.

في هذا الفيديو، سنقوم بتوضيح سهولة استخدام نظام BFC الخاص بنا. لاختبار البروتين وتفاعلات البروتينات في نظام تعبير يتجاوز الحدود العادية. أولاً، تحتاج إلى تحضير مزرعة بكتيرية من GV 3 1 0 1.

يتعين عليك اختيار مستعمرة واحدة من الطبق وتلقيحها في 5 مل من وسط YEB مع المضادات الحيوية المناسبة. بعد ذلك، يجب رج هذه المزارع طوال الليل عند درجة حرارة 28 °C. وتكون السرعة 200 دورة في الدقيقة.

يجب أن تكون المزارع البكتيرية جاهزة في صباح اليوم التالي. تأكد من عدم نمو البكتيريا بشكل مفرط. أخرج المزارع من الحاضنة وانقل عينة واحدة من كل مزرعة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 ملل.

ضع أنابيب الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مكتبي. قم بترسيب البكتيريا عند 1000 G لمدة 10 Minutes في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، اغسل الراسب بإضافة حجم واحد من وسط الغسيل وأعد تعليقه عن طريق النقر الخفيف بضع مرات.

كرر خطوة الغسيل لمرتين إضافيتين. هذا الأمر مهم لأنه يساعد في إزالة آثار المضادات الحيوية من الوسط البكتيري، والتي قد تؤدي إلى موت الخلايا النباتية بعد عملية الرشح. بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الراسب في 0.5 mL من وسط الرشح، ثم قم بقياس كثافة هذه المعلقات البكتيرية لتصل إلى 600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي، مع استخدام وسط الرشح كعينة ضابطة (blank control).

بعد قياس الكثافة الضوئية (OD)، يجب ضبطها باستخدام وسط الترشيح. يجب أن تتراوح الكثافة الضوئية النهائية بين 1 و 1.2. ينبغي تحضير جميع المعلقات البكتيرية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

انقل كمية متساوية من المعلقات البكتيرية المقابلة لبروتيناتك المرشحة الاثنين وامزجهما في أنبوب 1.5 مل جديد. أصبح خليط البكتيريا الآن جاهزاً للتنقيح. قم بتحضير جميع التوليفات ولا تنسَ تضمين ضابط سلبي. يجب استخدام نباتات Nicotiana benthamiana بعمر خمسة إلى ستة أسابيع من أجل عملية التنقيح.

يمكنك إخراج النباتات من غرفة النمو ووضعها في الضوء لمدة ساعة واحدة قبل عملية الرشح لفتح الثغور. سيساعد ذلك في عملية الرشح. اسحب حوالي 100 µL من البكتيريا المعلقة في محلول Resus.

امزج باستخدام سرنجة ذات طرف مسننة (slipped tip) بدون إبرة. ضع طرف السرنجة مقابل الجانب السفلي من الورقة برفق. اسند الجانب العلوي من الورقة بإصبعك.

اضغط عمومًا على المكبس لأسفل. يجب أن تكون قادرًا على رؤية السائل وهو ينتشر عبر الورقة بينما تملأ المسافات الهوائية المتوسطة. بعد الترشيح، قم بتمييز الورقة المرشحة باستخدام قلم تحديد؛ وإلا، فلن تتمكن بعد يومين من التعرف على الورقة المرشحة. إذا كنت بحاجة إلى الترشيح بمزيج بكتيري مختلف، فتأكد من رش قفازاتك بـ 50% ethanol أو تغيير القفازات بين عمليات الترشيح.

حاول ترك مسافة مضلعة قدرها One meter بين عمليات الترشيح لمنع التلوث المتقاطع. يجب مراقبة إشارات PFA كل 24 hours من بدء الترشيح ولمدة تصل إلى خمسة أيام. يمكنك استخدام غلافي تغطية بمقاسين مختلفين لتثبيت العينة.

أولاً، ضع قطرة واحدة من الماء المقطر على غطاء شريحة مجهزة بفتحة. ثم اقطع قطعة صغيرة من نسيج السكين ضمن المنطقة المتخلخلة. حاول تجنب الوريد في العينة.

ضع نسيج السكين المقطوع في الماء الموجود على الشريحة، ثم غطه باستخدام غطاء سحب أصغر واضغطه برفق. يمكن الآن ملاحظة العينة تحت المجهر. نستخدم هنا مجهر NACA T CSS P two confocal لرؤية إشارة BIFC.

يمكن استخدام المجهر التقليدي أيضاً. ويوفر المجهر البؤري (Confocal) صوراً أفضل ويكشف عن الإشارات الضعيفة. يمكنك استخدام معيار YFP للكشف عن إشارات VFC في نظام NCAs P two هذا.

يمكنك ببساطة النقر المزدوج على إعداد YFP المسبق هنا، والذي سيقوم تلقائياً بتفعيل الإثارة وتحديد نطاق كشف الانبعاث. إذا كنت تستخدم نظاماً مختلفاً، يرجى الرجوع إلى الدليل لضبط المعلمات بشكل صحيح. نأمل أنه بعد مشاهدة هذا الفيديو، ستكون قادراً على إجراء BFCE لاختبار تفاعلات البروتين-بروتين باستخدام نظام التعبير unbe MI Transcend.

يمكنك أيضاً تطبيق هذا الإجراء على نباتات التبغ ونباتات AY. تحتوي ناقلات BFC الخاصة بنا أيضاً على علامة HA وعلامة flag على التوالي، لذا يمكنك أيضاً إجراء الترسيب المناعي المشترك (co IP) للتحقق من التفاعلات إذا لزم الأمر.