تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو رسم خرائط لمواقع تفاعل ACAP LBC مع PDE أربعة D ثلاثة. عن طريق قياس متوسط شدة التألق للجزيئية الحيوية أو الفلورة أو التكميل أو BC باستخدام قياس التدفق الخلوي. للقيام بذلك ، يتم نقل الخلايا باستخدام ACAP LBC و PDE أربعة D ثلاثة شظايا مدمجة في الجزء الطرفي N أو C من بروتين مراسل الفلورسنت.

ثم يتم إجراء قياس تدفق الزهرة الخلوي لتقييم التألق إذا تفاعلت شظايا البروتين مع كوكب الزهرة ومضانته. إذا لم تتفاعل شظايا البروتين ، فلن يتم الكشف عن تألق. يتم إجراء تحليل الدم الغربي المجاني لتحديد مستويات التعبير النسبي عن البروتين.

ثم يتم حساب قوة تفاعلات بروتين البروتين عن طريق تطبيع متوسط كثافة التألق YFP مع مستويات تعبير البروتين. تشير البيانات الناتجة إلى أن ارتباط PDE 43 ب ACAP LBC يتم بوساطة مناطق متعددة داخل PDE 43 ، بشكل أساسي من خلال المنطقة المحفوظة في المنبع الأولى أو UCR الأولى. المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية مثل الترسيب المناعي المشترك و BP C باستخدام المجهر أو أنها بسيطة نسبيا وحساسة وتسهل الفحص السريع لعدد كبير من الخلايا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات البروتين والبروتين ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا للكشف عن العوامل التي تنظم تفاعلات البروتين والبروتين لاكتشاف الأدوية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب تحديد الاستجابة الخطية B. يجب أن يكون التعبير عن البناء متشابها بحيث يمكن مقارنة شظايا البروتين المختلفة باستخدام النتيجة ببعضها البعض.

في التجارب الموضحة هنا ، يتم نقل الخلايا مع جزء طرفي N من مشتق YFP ، ودمج كوكب الزهرة في ACAP LBC كامل الطول والجزء الطرفي C من كوكب الزهرة مدمج في أحد ما يلي ، PDE E 43 كامل الطول ، المنطقة المحفوظة في المنبع واحد UCR واحد من PDE E 43 أو المنطقة المحفوظة في المنبع اثنين بالإضافة إلى المنطقة التحفيزية UCR R اثنين بالإضافة إلى CAT من PDE 43 في اليوم السابق للتعداء في ستة. حسنا ، تزرع صفائح زراعة الأنسجة البذور 1.2 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة HEC 2 9 3 T لكل بئر في ملليلترين من النمو الكامل. بذرة متوسطة ، ثلاثة آبار تحكم بالإضافة إلى ثلاثة آبار لكل اختبار.

يحتضن كوتران عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي استعد لتعداء تركيبات الحمض النووي للبلازما BC وناقل CFP ، والذي يتم نقله باستخدام تركيبات BS C كعلامة. لكل حالة ، أضف الكمية المناسبة من الحمض النووي إلى 250 ميكرولتر من وسط مصل Optum M1 الخالي.

في أنبوب معقم ، يكفي أنبوب واحد لنقل ثلاثة آبار. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من العبور LT كاشف واحد لكل ميكروغرام إلى خليط الحمض النووي المخفف والماصة برفق للخلط والحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة عند 250 ميكرولتر من خليط التعدي بالتنقيط إلى الخلايا ثم تحتضن عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية ، 24 ساعة.

بعد التألق بعد التعداء ، يجب أن تعبر الخلايا عن التألق الأصفر لإشارة BC و CFP للإبلاغ عن كفاءة التعداد. لتحضير الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، اغسلها أولا بملليلترين من PBS المثلج ، ثم افصل الخلايا عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من 0.05٪ ، تحتضن التربسين لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم باستخدام المجهر تحقق من انفصال الخلية.

بمجرد انفصال الخلايا ، قم بتحييد التربسين باستخدام مليلتر واحد من DMEM. بعد ذلك ، قم بنقل مليلتر واحد من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، ثم انقل 0.25 مل من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي صغير ثان. قم بتدوير الأنابيب في 500 جبن لمدة خمس دقائق.

ستتم معالجة عينة 250 ميكرولتر بشكل أكبر لقياس التدفق الخلوي. ضع عينة المليلتر الواحد جانبا على الجليد لتحليل الدم الغربي ، والذي يجب إجراؤه بالتوازي بعد الدوران Resus. تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس ووضعها على خلايا الجليد يمكن أيضا تثبيتها في 1٪ ألدهيد Paraform في PBS إذا لم يكن تحليل قياس التدفق الخلوي فوريا هنا ، يتم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام سماوي Beckman Coulter ، وهو DP مجهز ب 488 نانومتر 405 نانومتر و 642 نانومتر يتم استخدام برنامج قمة الليزر ذو الحالة الصلبة للاستحواذ والتحليل بعد معايرة مقياس التدفق الخلوي باستخدام الخرز القياسي ، رسم التشتت الأمامي أو FSC مقابل SSC المبعثر الجانبي على مقياس خطي والمشي على مجموعة الخلايا الحية.

الرسم التالي SSC مقابل عرض نبضة الجهد والمشي على مجموعة الخلايا الحية غير المجمعة. ثم ارسم FSC على مقياس خطي مقابل فلورة CFP عند 405 FL ستة على هذه الأداة على مقياس لوغاريتمي والمشي على الخلايا الموجبة CFP الحية غير المجمعة. أخيرا ، ارسم FSC على مقياس خطي مقابل مضان YFP عند 488 نانومتر FL واحد على هذه الأداة على مقياس لوغاريتمي لتصور شدة BC.

بعد ذلك ، قم بتشغيل العينة السالبة المزدوجة Y-F-P-C-F-P واضبط أنبوب مضاعف الصور F-S-C-S-C FL واحد و FL ستة أو جهد PMT لتعيين عتبة كل إشارة. بعد ذلك ، قم بتشغيل كل من العينات الموجبة المفردة YFP و CFP للتعويض المستقبلي دون اتصال بالإنترنت. تأكد من الحصول على ما لا يقل عن 10,000 حدث مسور.

أخيرا ، اجمع البيانات للعينات التجريبية بعد جمع البيانات. قم بإعداد بروتوكول التحليل حسب الاستحواذ مع النشر باستخدام البوابة الأولى في مخطط نقطة FS CSC للخلايا الحية. البوابة الثانية في نبضة FSC مع مخطط نقطي للبوابة الأولى للخلايا الحية غير المجمعة والبوابة الثالثة في مخطط نقطة ccfp FSC للبوابة الثانية للخلايا الحية غير المجمعة موجبة ccfp.

بعد تعويض إشارة YFP و CCFP في مخطط نقطة Y fp CFP باستخدام الخلايا الموجبة المفردة YFP و CFP ، نحدد خطوط القطع للخلايا الموجبة CFP و YFP. قم بتصدير متوسط شدة التألق YFP أو MFI للخلايا الإيجابية CFP للتفوق في رسم البيانات ، ثم في Excel ، قم بتطبيع Y-F-P-M-F-I إلى مستوى التعبير عن ACAP LBC PDE E 43 والتحكم في التحميل ألفا توبولين كما هو محدد بواسطة النشاف الغربي لتحديد النطاق الخطي لمتوسط شدة التألق YFP. تم نقل CFP مع VN ACAP L BBC وكميات متفاوتة من VC PDE E 43 في خلايا HEC 2 93 وتم تقييم التفاعل باستخدام قياس التدفق الخلوي BIF كما هو موضح في هذا الفيديو ، تظهر هذه المؤامرة تغيرا نسبيا في الطية في التعبير عن VC PDE E 43 كدالة ل VC PDE E 43 المنقولة.

يرتبط متوسط شدة التألق لكوكب الزهرة في الخلايا الموجبة CFP المشار إليها بالمربعات الزرقاء بتعبير VCDE 43 وكان متسقا مع مستويات التعبير التي يحددها تحليل الصورة للبقعة الغربية ، والتي يشار إليها بالمثلثات الحمراء. شوهد متوسط مماثل لكثافة التألق CFP بين العينات كما هو موضح في المربعات الخضراء وتم استخدامه كعنصر تحكم سلبي للحد من اختلافات الخلايا. تتحقق هذه النتائج من صحة استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد تفاعل ACAB LB C PDE 43 عن طريق قياس متوسط شدة التألق ل BS e مع تحديد الكمية المناسبة من تركيبات BIC المستخدمة للفحص لرسم خريطة مواقع ربط ACAP LBC ضمن تحليل PDE E 43 BIC لتفاعل ACAP LBC مع PDE E 43 fl.

تم تقييم منطقة UCR واحدة من PDE 43 و UCR two و CAT من PDE 43 باستخدام هذه الطريقة كما هو موضح هنا. يؤدي التعبير عن vn و ACAP و LBC و VC PDE 43 UCR و two plus CAT إلى انخفاض إشارة BC عند مقارنتها ب VC PDE 43 FL و VC PDE 43 UCR ، وقد لوحظ تعبير بروتين مماثل واحد في جميع عينات التدفق وتم تطبيع متوسط التألق إلى مستويات التعبير النسبية ل ACAP LBC PDE 43 و ALPHA TUBULIN. لذلك ، يشير B-C-M-F-I الطبيعي إلى أنه لا يوجد فرق في شدة التألق بين ACAP LBC PDE 43 FL و ACAP LBC PDE 43 UCR R one ، ولكن إشارة أقل بكثير لتفاعل ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT تفاعل.

تشير هذه النتائج إلى وجود مناطق متعددة في PDE 43 تتفاعل مع ACAP LBC وأن PDE 43 UCR R واحد هي المنطقة الأساسية للتفاعل مع ACAP LBC. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة البروتين وتفاعل البروتين عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي ل BP C.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد الكمية الصحيحة من BP C المستخدمة للحصول على تعبير بروتين مماثل واستجابة BP C الخطية. بعد هذا الإجراء, يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الببتيد أو المخاطر من أجل تحديد الأحماض الأمينية داخل PDE 40 D ثلاثة هي المسؤولة عن.

تفاعلات ACAP RBC.