تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مواقع تفاعل ACAP LBC مع PDE four D three، وذلك عن طريق قياس متوسط شدة الفلورة لتقنية تكامل الفلورة الجزيئية الحيوية (BC) باستخدام قياس التدفق الخلوي. ولتحقيق ذلك، يتم ترصيد الخلايا بقطع من ACAP LBC وPDE four D three مدمجة مع الطرف N أو الطرف C للبروتين المراسل الفلوري.

يتم بعد ذلك إجراء تحليل التدفق الخلوي لبروتين Venus لتقييم الفلورة في حال تفاعل شظايا البروتين، وبذلك يكتمل تحليل Venus وتظهر الفلورة. أما إذا لم تتفاعل شظايا البروتين، فلا يتم اكتشاف أي فلورة. ويتم إجراء تحليل لطخة ويسترن (western blot) مكمل لتحديد مستويات التعبير البروتيني النسبية.

يتم بعد ذلك حساب قوة التفاعلات البروتينية-البروتينية عن طريق معايرة متوسط كثافة الفلورة لبروتين YFP مع مستويات التعبير البروتيني. وتشير البيانات الناتجة إلى أن ارتباط PDE 43 بـ ACAP LBC يتم عبر مناطق متعددة داخل PDE 43، وبشكل أساسي من خلال المنطقة المحفوظة العلوية الأولى أو UCR one. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الترسيب المناعي المشترك و BP C باستخدام المجهر في أنها بسيطة نسبياً، وحساسة، وتسهل الفحص السريع لعدد كبير من الخلايا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول التفاعلات بين البروتينات، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لفحص العوامل التي تنظم التفاعلات بين البروتينات لغرض اكتشاف الأدوية. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن هناك حاجة إلى تحديد استجابة خطية لـ B. كما يجب أن يكون التعبير عن البنية متشابهاً بحيث يمكن مقارنة النتائج التي تستخدم قطع بروتينية مختلفة مع بعضها البعض.

في التجارب الموصوفة هنا، يتم إجراء ترنسفكشن مشترك للخلايا بقطعة النهاية النيتروجينية (N terminal) لمشتق YFP، وهو Venus المدمج مع البروتين ACAP LBC كامل الطول، وقطعة النهاية الكربوكسيلية (C terminal) لبروتين Venus المدمج مع أحد الخيارات التالية: PDE E 43 كامل الطول، أو المنطقة المحفوظة العلوية الأولى UCR one لبروتين PDE E 43، أو المنطقة المحفوظة العلوية الثانية بالإضافة إلى المنطقة الحفازة UCR R two plus CAT لبروتين PDE 43. في اليوم السابق للترنسفكشن، يتم استزراع 1.2 × 10⁵ من خلايا HEC 2 9 3 T لكل بئر في أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار، وذلك في 2 mL من وسط نمو كامل. يتم استزراع ثلاثة آبار كعينة ضابطة بالإضافة إلى ثلاثة آبار لكل مجموعة اختبار.

يتم تحضين Cotran في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم التحضير لعملية ترانسفكشن لنماذج BC plasma DNA وناقل CFP، والذي يتم ترانسفكشنه مع نماذج BS C كعلامة. لكل حالة، يتم إضافة الكمية المناسبة من DNA إلى 250 µL من وسط Optum M1 الخالي من المصل.

في أنبوب معقم، يكفي أنبوب واحد لنقل الجينات إلى ثلاث آبار. ثم أضف 3 µL من كاشف transit LT one لكل 1 µg من خليط DNA المخفف، واستخدم الماصة برفق للمزج، ثم حضن الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، أضف 250 µL من خليط نقل الجينات قطرة بقطرة إلى الخلايا، ثم حضنها في بيئة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C لمدة 24 ساعة.

بعد عملية ترصيف الجينات، افحص الفلورية باستخدام مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescence microscope)، حيث يجب أن تُظهر الخلايا فلورية صفراء لإشارة BC وفلورية CFP للإبلاغ عن كفاءة الترصيف. ولتحضير الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي، اغسلها أولاً بـ 2 mL من محلول PBS المبرد بالثلج، ثم افصل الخلايا بإضافة 250 µL من Trypsin بتركيز 0.05%، وتحضينها لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق عند 37 °C. بعد ذلك، استخدم المجهر للتأكد من انفصال الخلايا.

بمجرد انفصال الخلايا، قم بتحييد التربسين باستخدام 1 mL من DMEM. بعد ذلك، انقل 1 mL من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم انقل 0.25 mL من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ثانٍ. قم بتدوير الأنابيب بسرعة 500 g لمدة خمس دقائق.

سيتم إجراء معالجة إضافية للعينة التي حجمها 250 µL من أجل قياس التدفق الخلوي. يتم وضع عينة الـ 1 mL جانباً على الثلج لإجراء تحليل ويسترن للدم، والذي يجب تنفيذه بالتوازي بعد عملية إعادة التعليق (Resus) الناتجة عن الطرد المركزي. يتم تعليق الخلايا في 250 µL من منظم fax buffer ووضعها على الثلج، كما يمكن تثبيت الخلايا في 1% Paraform aldehyde في PBS إذا لم يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي فوراً. هنا، يتم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام جهاز Beckman Coulter cyan a DP مجهز بليزر الحالة الصلبة بأطوال موجية 488 nm و 405 nm و 642 nm. ويستخدم برنامج summit للاكتساب والتحليل؛ وبعد معايرة مقياس التدفق الخلوي باستخدام حبيبات قياسية، يتم رسم تشتت الأمام (forward scatter) أو FSC مقابل التشتت الجانبي (sideward scatter) SSC على مقياس خطي وتحديد بوابة (gait) على مجموعة الخلايا الحية.

بعد ذلك، قم برسم SSC مقابل عرض نبضة الجهد وقم بتحديد البوابة (gate) لمجتمع الخلايا الحية غير المتكتلة. ثم ارسم FSC بمقياس خطي مقابل فلورية CFP عند 405 FL six في هذا الجهاز بمقياس لوغاريتمي، وقم بتحديد البوابة للخلايا الحية الموجبة لـ CFP وغير المتكتلة. وأخيراً، ارسم FSC بمقياس خطي مقابل فلورية YFP عند 488 nanometers FL one في هذا الجهاز بمقياس لوغاريتمي لتصور كثافة BC.

بعد ذلك، قم بتشغيل عينة Y-F-P-C-F-P السلبية المزدوجة واضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) لـ F-S-C-S-S-C FL one و FL six لتحديد حد العتبة لكل إشارة. ثم قم بتشغيل عينات YFP و CFP الإيجابية المفردة من أجل التعويض غير المتصل (offline compensation) لاحقاً. تأكد من الحصول على 10,000 حدث محدد بوابي (gated events) على الأقل.

أخيرًا، قم بجمع البيانات للعينات التجريبية بعد عملية جمع البيانات. قم بإعداد بروتوكول التحليل وفقًا لعملية الاستحواذ مع التدرج باستخدام البوابة الأولى في مخطط النقاط FS CSC للخلايا الحية. والبوابة الثانية في نبضة FSC مع مخطط نقاط للبوابة الأولى للخلايا الحية غير المتكتلة، والبوابة الثالثة في مخطط نقاط ccfp FSC للبوابة الثانية للخلايا الحية الموجبة لـ ccfp وغير المتكتلة.

بعد التعويض عن إشارات YFP وCCFP في المخطط النقطي لـ Yfp CFP باستخدام الخلايا الموجبة لـ YFP وCFP بشكل فردي، نحدد خطوط القطع للخلايا الموجبة لـ CFP وYFP. يتم تصدير متوسط شدة الفلورة (MFI) لـ YFP للخلايا الموجبة لـ CFP إلى برنامج excel لرسم البيانات، ثم يتم في Excel معايرة Y-F-P-M-F-I وفقاً لمستوى تعبير ACAP LBC PDE E 43 وعنصر التحكم في التحميل alpha tubulin كما تم تحديده بواسطة لطخة ويسترن لتحديد النطاق الخطي لمتوسط شدة الفلورة لـ YFP. تم إدخال CFP بالتزامن مع VN ACAP L BBC وكميات متفاوتة من VC PDE E 43 في خلايا HEC 2 93، وتم تقييم التفاعل باستخدام قياس التدفق الخلوي ثنائي الفلورة كما هو موضح في هذا الفيديو؛ يوضح هذا المخطط التغير النسبي في طي تعبير VC PDE E 43 كدالة لـ VC PDE E 43 التي تم إدخالها.

أشار متوسط كثافة الفلورة لبروتين Venus في الخلايا الموجبة لـ CFP، والمتمثلة في المربعات الزرقاء، إلى وجود ارتباط مع تعبير VCDE 43، وكان ذلك متسقاً مع مستويات التعبير التي تم تحديدها من خلال تحليل صور لطخة ويسترن، والمشار إليها بالمثلثات الحمراء. وقد لوحظ متوسط كثافة فلورة مماثل لـ CFP بين العينات، كما هو موضح في المربعات الخضراء، واستُخدم كضابط سلبي للحد من التباينات الخلوية. وتؤكد هذه النتائج صحة استخدام قياس التدفق الخلوي لتقدير كمية التفاعل بين ACAB LB C PDE 43 عن طريق قياس متوسط كثافة الفلورة لـ BS e، بينما يتم في الوقت ذاته تحديد الكمية المناسبة من بنيات BIC المستخدمة في الفرز لرسم خرائط مواقع ارتباط ACAP LBC ضمن PDE E 43 BIC لتحليل تفاعل ACAP LBC مع PDE E 43 fl كامل الطول.

تم تقييم المنطقة UCR one من PDE 43 ومنطقتي UCR two و CAT من PDE 43 باستخدام هذه الطريقة كما هو موضح هنا. أدى التعبير عن vn ACAP LBC و VC PDE 43 UCR two plus CAT إلى إشارة BC أقل عند مقارنتها بـ VC PDE 43 FL و VC PDE 43 UCR one، ولوحظ تعبير بروتيني مماثل في جميع عينات التدفق، وتم تطبيع متوسط الفلورة بالنسبة لمستويات التعبير النسبية لـ ACAP LBC PDE 43 و alpha tubulin. وبناءً على ذلك، يشير B-C-M-F-I المطبع إلى عدم وجود فرق في شدة الفلورة بين ACAP LBC PDE 43 FL و ACAP LBC PDE 43 UCR R one، ولكن لوحظت إشارة أقل بكثير لتفاعل ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT.

تشير هذه النتائج إلى وجود مناطق متعددة في PDE 43 تتفاعل مع ACAP LBC، وأن PDE 43 UCR R one هي المنطقة الأساسية للتفاعل مع ACAP LBC. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة التفاعل بين البروتينات عن طريق تحليل BP C باستخدام قياس التدفق الخلوي. عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تحديد الكمية الصحيحة من بناء BP C المستخدمة للحصول على تعبير بروتيني مماثل واستجابة خطية لـ BP C. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الببتيد أو risk من أجل تحديد الأحماض الأمينية المسؤولة عن ذلك ضمن PDE 40 D three.

تفاعلات ACAP مع خلايا الدم الحمراء.