أسلوب التصوير الكالسيوم في تطوير شبكات القشرية
أكتوبر 22, 2011
ويمكن قياس النشاط العفوي لتطوير شبكات الخلايا العصبية باستخدام AM - استر أشكال الأصباغ مؤشر الكالسيوم الحساسة. تم الكشف عن التغييرات في الكالسيوم بين الخلايا ، مما يدل تنشيط الخلايا العصبية ، والتغييرات في مضان عابرة مع مؤشر واحد أو اثنين الفوتون التصوير. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لمجموعة من الشبكات التي تعتمد على الخلايا العصبية تنمويا في المختبر.
الهدف العام من هذا الفيلم هو توضيح كيفية قياس نشاط الشبكة من تطوير شرائح الدماغ القشرية باستخدام مؤشر الفلورسنت الحساس للكالسيوم. تصنع شرائح الدماغ DY من القشرة المعوية النامية للفأر الصغير. يتم تحميل كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية بعلامات تعتمد على الكالسيوم.
تعكس التغييرات في تألق الأصباغ المعتمدة على الكالسيوم التغيرات في النشاط الخلوي. يمكن تلطيخ الخلايا غير العصبية ، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية باستخدام أصباغ واسمات محددة. يتم تسجيل نشاط الشبكة القشرية باستخدام الفاصل الزمني يتم اكتشاف خلايا التصوير متعددة الفوتون داخل الشبكة عن طريق إنشاء مجموعة ثلاثية الأبعاد من الصور عبر منطقة الاهتمام.
يمكن بعد ذلك تحليل التغييرات في التألق الخلوي عبر خلايا متعددة لقراءة نشاط الشبكة القشرية النامية. النمط المميز للنشاط في الجهاز العصبي النامي هو نشاط الشبكة المتزامن التلقائي. لوحظ نشاط متزامن في العديد من المناطق العصبية النامية المختلفة ، بما في ذلك قشرة الحبل الشوكي السليمة ومستحضرات الثقافة العصبية المنفصلة خلال فترات النشاط التلقائي للخلايا العصبية ، التي يتم إزالة الاستقطاب إلى النار ، والمسامير المفردة أو رشقات نارية من إمكانات العمل التي تنشط العديد من قنوات الحديد ، بما في ذلك قنوات الكالسيوم ذات الجهد المسور مما يؤدي إلى تدفق الكالسيوم.
تم قياس النشاط المتزامن للغاية من الشبكات المحلية باستخدام أقطاب كهربائية ميدانية أو مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية. تتيح هذه معدلات أخذ العينات الزمنية العالية ، ولكنها تعطي دقة مكانية أقل بسبب القراءة المتكاملة لنشاط الخلية. يمكن تحليل الخلية المفردة للنشاط العصبي باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح للخلايا العصبية المفردة لقياس معدلات إطلاق النار.
ومع ذلك ، فإن القدرة على القياس من الشبكة تقتصر على عدد الخلايا العصبية التي تم تصحيحها في وقت واحد ، وعادة ما تكون خلية عصبية واحدة أو اثنتين فقط. مكن استخدام أصباغ مؤشر الفلورسنت المعتمدة على الكالسيوم من قياس النشاط المتزامن عبر شبكة من الخلايا. وتعطي هذه التقنية استبانة مكانية عالية وأخذ عينات زمنية كافية لتسجيل النشاط التلقائي للشبكة النامية.
تحتوي المؤشرات الحساسة للكالسيوم الفلوري مثل إستر URA 2:00 AM على مجموعات حمض الكربوكسيل القادرة على ربط مناجم الكالسيوم. يتم تنشيط هذه الأصباغ الفلورية بواسطة أطوال موجية ضوئية محددة إما باستخدام فوتون واحد أو اثنين من المجهر. يتم تغيير عدد الفوتونات المنبعثة من الصبغة بشكل عابر عند ارتباط الكالسيوم.
يتم الإبلاغ عن هذا التغيير في عدد الفوتون أو التألق على أنه إشارة دلتا FF ويتوافق مع تغير في مستوى الكالسيوم داخل الخلايا العصبية. يعد قياس التغيرات في المؤشرات الحساسة للكالسيوم مقياسا مفيدا لأنماط نشاط الشبكة في الخلايا النامية. مرحبا ، أنا ريانا مورتي ، واسمي جولي أبوتس.
نحن من قسم الفيزيولوجيا العصبية التفسيرية والجامعة في أمستردام. لقد استخدمنا تصوير الكالسيوم لدراسة النشاط الوظيفي في تطوير الأنسجة في قشرة الفأر باستخدام مؤشرات حساسة للكالسيوم في التصوير متعدد البؤر. الهدف من هذا الفيلم القصير هو توضيح كيف يمكن استخدام هذه الأساليب لقياس أنماط النشاط التلقائي والاستحضار في تطوير الشبكات في الجهاز العصبي.
إزالة الدماغ بسرعة من جمجمة فأر صغير لتقليل الضرر الذي يلحق بالدوائر العصبية. قم بتشريح الدماغ في محلول شريحة مثلجة. يحتوي محلول الشريحة على كلوريد الكولين بدلا من الصوديوم المستخدم بشكل شائع في A TSF للتسجيلات العصبية.
في هذه التجارب ، نصنع شرائح دماغ من القشرة المعوية لدماغ الفأر النامي. ضع قطعة من ورق الترشيح فوق طبق بترو وبللها ببضعة ملليلتر من A TSF. انقل الدماغ إلى قطعة من ورق الترشيح.
قم بتقسيم نصفي الكرة الأرضية باستخدام شفرة حلاقة ذات حافة واحدة. افصل بين نصفي الكرة الأرضية. ضع واحدة مرة أخرى في محلول الشريحة الجليدية مع نصف الكرة المتبقي.
قم بإزالة المخيخ بشفرة الحلاقة. اقلب نصف الكرة الأرضية على خط الوسط ، وقم بعمل قطع بمقدار ملليمتر واحد تقريبا من السطح الظهري بزاوية طفيفة للشفرة باتجاه الطرف المنقاري. اقلب الدماغ.
سطحه المقطوع مؤخرا باستخدام طائر قطني وملعقة معدنية. انقل الدماغ إلى كتلة القطع المعدنية. ادفع الدماغ برفق بعيدا عن الملعقة بطائر قطني على السطح الملصق.
يتم قطع شرائح الدماغ 300 ميكرومتر لسرعات قطع الأنسجة الصغيرة وعادة ما يكون تردد الشفرة أبطأ من تلك المستخدمة للأنسجة الأكثر نضجا. بمجرد التقطيع ، انقل كل شريحة باستخدام ماصة زجاجية يتم نقل الشرائح إلى غرفة التثبيت ، والتي تحتوي على A TSF المؤكسج في درجة حرارة الغرفة. يحتوي السائل الدماغي النخاعي A على نسبة أعلى من المغنيسيوم إلى الكالسيوم من محلول السائل الدماغي النخاعي.
تستخدم لتسجيل الشرائح تترك لمدة ساعة واحدة حتى تتعافى. لتحميل الخلايا بمؤشر يعتمد على الكالسيوم أو علامات خاصة بالخلية ، يجب نقل شرائح معينة إلى غرفة لإجراء تلطيخ. على الرغم من توفر الغرف التجارية ، إلا أنه يمكن بسهولة تجميع أحدها من معدات المختبرات القياسية بتكلفة قليلة جدا.
لصنع غرفة تلطيخ ، ستحتاج إلى معدات المختبر الأساسية التالية ، وطبقين بلاستيكيين من بتري ، وحقنة واحدة سعة 10 مليلتر ، وقسم من أنابيب السيليكا ، وملحق ثقافة الخلايا مع غراء فائق غشاء شبه منفذ ، وثلاثة موصلات أنابيب صغيرة ، وإبرة محمولة ناعمة. خذ طبق بتري الكبير واصنع ثقبا صغيرا بقضيب ساخن من خلال الجدار الجانبي. خذ طبق بتري الصغير واصنع ثقبا بقطر مماثل الحجم كبيرا بما يكفي لمرور أنابيب السيليكون.
مرر جزءا من أنابيب السيليكون عبر الفتحة وشكل حلقة داخل الطبق الصغير. استخدم الغراء الفائق لإغلاق الطرف المفتوح للأنبوب. ثم قم بلصق ما تبقى من الأنبوب على الجدار الداخلي لطبق بتري الصغير.
ضع طبق بتري الصغير في وسط الطبق الكبير وألصقه في مكانه. خذ الطرف المتبقي من أنبوب السيليكون وقم بتمريره عبر الفتحة الصغيرة الموجودة في الجدار الجانبي لطبق بتري. خذ إبرة رفيعة وقم بعمل ثقوب صغيرة في أنابيب السيليكون داخل طبق بتري.
اصنع الثقوب على فترات متباعدة بشكل متساو لاندماج متساو. خذ مزرعة خلوية جيدا باستخدام غشاء شبه منفذ باستخدام مشرط ساخن. اقطع السنتيمتر العلوي من البئر لترك طبق ضحل لتثبيت الشرائح أثناء الحضانة.
ضع الطبق الضحل في وسط الطبق الصغير المحاط بأنابيب السيليكون المسامية. اصنع ثقبا قطره حوالي نصف إلى سنتيمتر واحد في غطاء الطبق الكبير. خذ حقنة بلاستيكية سعة 10 ملليلتر باستخدام مشرط ساخن.
قم بعمل قطع بزاوية لإزالة نهاية المحقنة. ضع الغراء الفائق على السطح المقطوع لأنبوب المحقنة. قم بلصق هذا مباشرة فوق الفتحة الموجودة على غطاء طبق بتري الكبير.
قم بتوصيل موصل أنبوب بنهاية طرف المحقنة. ضع الطبق الضحل في وسط طبق بتري الصغير مع التأكد من أن أنبوب الغاز المسامي موجود حول الطبق. ثم يتم توصيل هذا الأنبوب بإمداد غاز الكربوجين لأكسجين الشرائح.
أثناء الحضانة ، استبدل غطاء الطبق الكبير ، والذي يتم توصيله أيضا مباشرة بإمداد الغاز عبر طرف المحقنة. سيؤدي ذلك إلى توفير إمدادات من السيارة والغاز فوق الشرائح أثناء الحضانة لتجنب تبييض الصبغة. يتم تنفيذ جميع الإجراءات بأقل قدر ممكن من الضوء ، ويتم الاحتفاظ بكل من الصبغة والشرائح في الظلام.
املأ غرفة التلوين بحوالي مل ونصف من A TSF من حامل الشريحة. ضع حجرة الواجهة بالداخل واملأها بمليلتر آخر من A TSF. من المهم الحفاظ على إمدادات جيدة من الأكسجين للحفاظ على صحة الأنسجة وللتحميل الجيد للشريحة.
يحدث التلوين عند حوالي 35 درجة مئوية لتسهيل امتصاص الصبغة في الخلايا العصبية أثناء تسخين غرفة التلوين. تحضير صبغة المؤشر ل 2:00 صباحا إستر. أضف تسعة ميكرولترات من DMSO مع ميكرولتر واحد من حمض الأونيك إلى قارورة 50 ميكروغرام.
DMSO وحمض الأونيك. تعمل كعوامل بيرم لتمكين امتصاص الصبغة من خلال الغشاء الدهني. دوامة القارورة لمدة 15 دقيقة للتأكد من ذوبان الصبغة تماما.
للتلوين ، انقل كل شريحة إلى الواجهة. أدخل في غرفة التلوين. قم بتنظيف الصبغة مباشرة على منطقة الاهتمام فوق الشرائح ، وأغلق غطاء غرفة التلوين.
اترك الشرائح محتضنة في الظلام لمدة 20 إلى 40 دقيقة حسب عمر الماوس المستخدم. بعد الحضانة ، انقل الشرائح مرة أخرى إلى حامل الشريحة لغسل أي صبغة زائدة متبقية. يمكن أيضا تكييف بروتوكولات التلوين لتصوير الكالسيوم مع الأنسجة القديمة.
هذا يتطلب خطوة إضافية من الحضانة المسبقة. انقل الشرائح القديمة إلى طبق حضانة ضحل مليء بثلاثة ملليلتر من السائل الدماغي النخاعي وثمانية ميكرولترات من محلول الكريما الرابع عند 0.5٪ الحرارة إلى 35 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم انقل الشرائح إلى الواجهة ، وأدخلها في غرفة التلوين ، واتبع إجراءات التلوين العادية.
من الممكن أيضا تلطيخ هذه الشرائح للخلايا غير العصبية ، وهي الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية. يمكن استخدام كرم الكبريت 1 0 1 لتلطيخ الخلايا النجمية لدومين الكبريت. اصنع محلولا من 10 ميكرومولار الصبغة الأرجوانية فوق منطقة الاهتمام في الشرائح.
اتركيه للاحتضانة لمدة 15 دقيقة. انقل الشرائح مرة أخرى إلى حجرة الاحتجاز لإزالة أي صبغة زائدة. يمكن أن يلطخ اقتران FSE من ليكتين الطماطم للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البطانية.
بالنسبة لليكتين الطماطم ، اصنع محلولا من 20 ميكروغراما لكل ملليلتر. قم بتنظيف الصبغة فوق منطقة الاهتمام في الشرائح. اترك الشرائح لتحتضن لمدة 45 دقيقة.
ثم انقل الشرائح مرة أخرى إلى غرفة الاحتجاز. أثناء التصوير ، يجب أن تكون شرائح مستقرة تحت المجهر. عادة ما يتم وضع قيثارة معدنية لتثبيت الأنسجة ، ومع ذلك يمكن أن تشوه سطح الشريحة بشكل غير متساو مما يعطي مجال رؤية محدودا فقط في التركيز للتصوير لتجنبه.
هذه الشرائح ملتصقة بغرفة التسجيل باستخدام محلول البولي إيتالين أو PEI. PEI هو بوليمر يستخدم لتعزيز ارتباط الخلايا بالسطح لمدة ساعة واحدة على الأقل. قبل وضع الشرائح في غرف التسجيل ، املأ هذه الغرف ببضعة ملليلتر من محلول PEI لتغطية أرضية الغرفة.
أولا ، اشطف PEI من الغرفة بالماء المقطر ، متبوعا بمحلول السائل الدماغي النخاعي العابر. انقل شريحة إلى غرفة التسجيل وقم بإزالة محلول السائل الدماغي النخاعي الزائد. ضع الشريحة في منتصف الغرفة باستخدام فرشاة رسم دقيقة.
قم بإزالة كل ما عنه من السائل الدماغي النخاعي باستخدام قطع صغيرة من ورق الترشيح الماص. احرص على التأكد من أن الشريحة لا تحتوي على CSF حول حوافها. أخيرا ، قم بتنظيف نصف ملليلتر من السائل النخاعي برفق على الشريحة دون فكها من الغرفة.
ضع الغرف في حاوية واجهة كبيرة مؤكسجة واتركها لمدة ساعة أخرى في الظلام. يمكن تسجيل التغييرات في أصباغ المؤشرات الحساسة للكالسيوم إما باستخدام فحص مجهر فوتوني واحد أو اثنين. نستخدم ليزر الياقوت المصنوع من التيتانيوم مقترنا بمجهر أوليمبوس لتمكين تصوير فوتونين في شبكاتنا العصبية.
بالإضافة إلى ذلك ، نستفيد من نظام نطاق تقليم التكنولوجيا الحيوية L Vision مع كاميرا EM CCD المطرقة MATSU لزيادة معدلات مسح الإطار. ضع حجرة الشريحة تحت المجهر مع تدفق ثابت من A-T-S-F-A-T-S-F المؤكسج الذي يحتوي على 1.6 مللي مولار من الكالسيوم و 1.5 مللي مولار. يتم تسخين المغنيسيوم إلى حوالي 30 درجة مئوية في الإعداد باستخدام الضوء الأبيض.
حدد موقع منطقة الاهتمام في الشريحة وركز على السطح. أطفئ الأنوار وأغلق باب خزانة التسجيل. لتقليل مستويات إضاءة الخلفية.
تتوفر العديد من حزم البرامج التجارية أو المفتوحة المختلفة لتسجيل الصور وتحليلها في مختبرنا ، نستخدم برنامج المفتش للاستحواذ من Lavis Biotech. لبدء التصوير، حدد وضع كاميرا CCD للكشف. اضبط الطول الموجي المناسب للمؤشر الخاص بك.
بالنسبة إلى 2:00 صباحا إستر ، قمنا بضبط الإثارة على 820 نانومتر في برنامج نطاق القطع. حدد وضع المسح الضوئي 64 B. اختر الحجم الأمثل لمجال الرؤية ودقة البكسل لمنطقة اهتمامك.
حدد معدل الإطارات المناسب ودوران البكسل إذا لزم الأمر لأخذ عينات الصورة. افتح غالق الليزر جاهزا للتصوير المستمر. استخدام وضع التصوير المستمر.
اضبط الكسب وشدة الليزر وركز على الشبكة العصبية التي ترغب في تصويرها. أوقف المسح. حدد إعدادات اللقطات المتتابعة لمعدل الإطارات ومدة التسلسل.
بعد التصوير بفاصل زمني ، قم بعمل مجموعة Z من الصور التي تحدد 20 ميكرون أعلاه و 20 ميكرون أدناه في خطوات ميكرون واحدة. يتم استخدام مكدس Z هذا للكشف عن الخلايا أثناء التحليل. قم بتصدير الملفات المسجلة كمجموعة من صور TIFF.
في الختام ، أظهرنا استخدام مؤشرات الكالسيوم لقياس نشاط الشبكة العفوية المتزامن في القشرة النامية. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول المنهجية والكواشف في أوراق البيانات المصاحبة لهذا الفيلم لتمكينك من إعداد التقنية في مختبرك الخاص.
النظرة العامة
تظهر هذه الدراسة طريقة لقياس نشاط الشبكة في شرائح الدماغ القشرية النامية باستخدام مؤشرات فلورية حساسة للكالسيوم. يسمح البروتوكول بملاحظة النشاط المتزامن التلقائي في الشبكات العصبية من خلال تقنيات التصوير المتقدمة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات التصوير
الخلفية
- يتم استخدام المؤشرات الفلورية الحساسة للكالسيوم لقياس النشاط العصبي.
- النشاط المتزامن التلقائي هو السمة المميزة للشبكات العصبية النامية.
- يمكن صبغ أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا النجمية، للتصوير.
- يسمح التصوير متعدد الفوتون بمدة زمنية قصيرة بالمراقبة عالية الدقة لنشاط الشبكة.
هدف الدراسة
- لإظهار استخدام التصوير الكالسيوم في دراسة النشاط الوظيفي في أنسجة قشرية فئران نامية.
- لتوضيح طرق قياس أنماط النشاط التلقائي والمستثار.
- لتوفير بروتوكول لتحضير وتصور شرائح الدماغ.
الطرق المستخدمة
- تحضير شرائح الدماغ من قشرة الفأر النامية.
- تحميل الخلايا بمؤشرات تعتمد على الكالسيوم.
- التصوير متعدد الفوتون بمدة زمنية قصيرة لتسجيل نشاط الشبكة.
- تحليل تغيرات الفلورية لتقييم النشاط الخلوي.
النتائج الرئيسية
- قياس ناجح للنشاط المتزامن عبر الشبكات العصبية.
- إظهار فعالية الأصباغ الحساسة للكالسيوم في التقاط التغيرات الديناميكية في الفلورية.
- تحديد أنماط النشاط التلقائي في الشبكات القشرية النامية.
- دقة مكانية عالية تحققت من خلال تقنيات التصوير المتقدمة.
الاستنتاجات
- يوفر استخدام التصوير الكالسيوم رؤى قيّمة حول النشاط الوظيفي للشبكات العصبية النامية.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لمختلف الثقافات العصبية والمراحل التنموية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنيات لاستكشاف ديناميكيات الشبكة العصبية بشكل أكبر.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Functional calcium imaging enables high-resolution mapping of spontaneous synchronized activity in developing cortical networks, a key process in early neurodevelopment. This approach supports target validation by linking network dynamics to circuit formation mechanisms relevant to neuropsychiatric disorder models. The technique provides predictive confidence in preclinical models by capturing functional readouts that correlate with synaptic maturation and plasticity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring network-level calcium flux as a proxy for neuronal excitability and synaptic connectivity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantification of synchronized activity patterns that reflect functional circuit maturation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate network synchrony in disease-relevant developing cortical systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with cell-type-specific labeling (neurons and astrocytes) for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Delivers high-spatial-resolution, temporally sampled delta F/F signals enabling detection of activity changes across multicellular networks.
- Screening Scalability: Facilitates reliable compound evaluation by capturing network-wide responses rather than single-cell measurements, improving assay physiological relevance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early cortical network dysfunction implicated in neurodevelopmental disorders, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing a functional readout of network activity that can be tracked across developmental stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by measuring compound effects on spontaneous network synchrony, a mechanistic indicator of circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional network activity data that informs target engagement and lead optimization decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neurodevelopmental targets by measuring changes in network synchrony as a functional biomarker of circuit formation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible calcium flux readouts with cellular resolution, enabling comparison of drug effects across neuronal and glial populations.
- Analytics: Generates quantitative delta F/F measurements that allow teams to compare conditions and assess compound-induced modulation of network dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling activity patterns known to regulate synaptogenesis and plasticity, processes disrupted in neuropsychiatric conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal study of network development across genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of network-level activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined slice preparation, dye loading, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets based on functional network phenotypes rather than molecular binding alone.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue or modulate pathological network synchrony in developing cortical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, multiphoton microscopy, and calcium imaging probe handling.
- Depends on access to titanium sapphire lasers, multiphoton systems, and environmental control for slice viability.
- Necessitates cross-team standardization between neurobiology and imaging teams for consistent slice preparation and data analysis.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different developmental stages or disease models.
- Limited by photobleaching and dye toxicity during prolonged imaging, requiring optimization of excitation intensity and incubation conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:03
Title
3:00
Step 1 Making horizontal hippocampal/cortical slices from young mouse brain
5:57
Step 2 Preparation of the staining chamber
8:48
Step 3 Staining of slices
10:21
Step 4 Non-neuronal dyes and older tissue
12:02
Step 5 Attaching slice to recording chamber
13:36
Step 6 Imaging
15:58
Conclusion
