العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام 'جينوم فيروس واحد'

العام من هذا الإجراء هو عزل المتغيرات الفردية من اتحادات مختلطة وتسلسل المواد الجينومية التي تم الحصول عليها لتحديد الفيروسات من مجموعة متنوعة من البيئات دون الحاجة إلى الزراعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل المتغيرات الفردية أولا باستخدام الفرز الخلوي للتدفق على حبات آرو. ثم يتم التحقق من صحة التقاط أيون واحد عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

بعد ذلك ، يتم عزل المادة الجينومية عن الأيون وتضخيمها باستخدام تضخيم الإزاحة المتعددة أو MDA لتوليد كمية الحمض النووي اللازمة للتسلسل. أخيرا ، يتم تسلسل الحمض النووي الفيروسي باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية لتوليد تغطية زائدة لجينوم الفيروس مما يساعد بشكل كبير في تجميع الجينوم والتعليق التوضيحي. في النهاية ، تسمح تقنيات المعلوماتية الحيوية التي تهدف إلى استخدام مناهج أخذ العينات الفرعية المتسلسلة لزيادة حجم الاختبار بتحليل الأصوات المعزولة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيئة الفيروسية من خلال إعطاء سياق جيني للمجموعة الواسعة من جينات عوالق OC المشروحة ، بالإضافة إلى تمكين اكتشاف جينومات جديدة من أنظمة بيئية متنوعة. بشكل عام ، قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تضخيم وعزل الأيونات المفردة يدفع حدود التكنولوجيا الحالية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نقيم استخدام MDA على مجتمعات عوالق Vero وأدركنا أنه من الممكن فرز جسيم فيروسي واحد وتسلسله وبالتالي تجميع جينوم فيروسي كامل من هذه المجتمعات المعقدة لفرز الفيروسات باستخدام مقياس التدفق الخلوي المجهز بأنابيب مضاعفة ضوئية مبعثرة أمامية مخصصة أو F-S-C-P-M-T تبدأ بتخفيف الجسيمات الفيروسية في 0.1 ميكرون مرشحة ثلاثية ، EDTA لمجموعة مختلطة تحتوي على جسيمات T four و lambda phage تعيين F-S-C-P-M-T على 1000 و SSC إلى 200 لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء.

بعد تشغيل عينات التحكم ، قم بتشغيل حوالي 100 ميكرولتر من التعليق الفيروسي المستمر إلى ما مجموعه 5000 حدث. ثم استخدم مخططات CYBER GREEN و F-S-C-P-M-T لوضع بوابة محكمة في وسط الجسيمات الفيروسية. أضف الآن خمسة ميكرولترات من نقطة انصهار منخفضة 1٪ في مخزن مؤقت TBE المبرد إلى 37 درجة مئوية إلى كل بئر على شريحة المجهر A-P-T-F-E ثم قم بتحميل الشريحة في مقياس التدفق الخلوي لالتقاط الجسيمات الفيروسية التي تم فرزها.

ابدأ في الفرز ، والتقاط 10 أحداث أو أكثر من الجسيمات الفيروسية في بعض الآبار للمساعدة في اكتشاف عمق الفيروسات أثناء الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر. عند اكتمال الفرز ، قم بإزالة الشريحة من مقياس التدفق الخلوي وأضف خمسة ميكرولترات أخرى من نقطة الانصهار المنخفضة المبردة إلى 37 درجة مئوية لكل بئر. تضمين الجسيمات الفيروسية للمتغير الفردي.

اضبط مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر على 488 نانومتر. ثم قم بتصوير الجسيمات المضمنة باستخدام هدف مسافة عمل طويلة 63 × للتحقق من وجود جسيم واحد فقط وأن فيروسات متعددة غير مكدسة فوق بعضها البعض. ثم بمجرد تحديد الآبار التي تحتوي على فيروسات مفردة ، استخدم شفرة حلاقة لإزالة حبات agros المرغوبة من الشريحة ووضعها في أنبوب PCR معقم.

ضع الأنبوب في الكتلة الحرارية لجهاز تدوير حراري مضبوطة على 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لقمل الجسيم الفيروسي في الموقع. ثم بعد إجراء MDA المعدل ، قم بنقل الحمض النووي الجيني إلى أنابيب إينور سعة 1.7 مليلتر وأضف حجما واحدا عاشرا من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار في المخزن المؤقت TBE لتنقية المادة الجينومية المضخمة ، ضع العينات عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابة الحقول ثم حرك الأنابيب إلى 42 درجة مئوية لتقليل درجة الحرارة قبل إضافة الإنزيم. أضف الآن وحدتين من بيتا aase إلى كل أنبوب واحتضان الأنابيب لمدة ساعتين.

ثم أضف حجما واحدا من محلول الفينول المشبع المخزن المؤقت إلى كل أنبوب. امزج بقوة وقم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 15 دقيقة عند 3 ، 500 مرة G.At درجة حرارة الغرفة ، وانقل الحمض النووي المحتوي على المواد الطافية إلى أنبوب einor جديد سعة 1.7 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف حجما واحدا من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ وميكرولتر واحد من الجليكو الأزرق إلى الأنابيب واقلب الأنابيب لتختلط بعد الطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى.

هذه المرة لمدة 60 دقيقة عند 28،000 مرة جم وأربع درجات مئوية. صب الأيزوبروبانول ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات وإضافة 150 ميكرولتر من 70٪ إيثانول إلى كل أنبوب. قم بتدوير الأنابيب لمدة 10 دقائق عند 28،000 مرة.

G في درجة حرارة الغرفة. صب الإيثانول في الهواء الجاف ، حبيبات الحمض النووي وإعادة تعليق الحمض النووي في حجم مناسب من عازلة tris EDTA. توضح إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لجسيم فيروسي ملطخ باللون الأخضر السيبراني داخل سرعة زراعية كيف يمكن استخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر لتصور وتأكيد أنه يتم الحصول على فيريون واحد في كل بئر بعد التقاطها ودمجها في aros ، يظهر الجزء الداخلي تكبيرا أعلى للجسيم الفيروسي المعزول.

هنا يتم عرض مخطط جانبي للتألق النسبي للجسيم الفيروسي الفردي الملون داخل حبة aros. توضح هذه السلسلة الأخيرة من الأرقام كيف تم استرداد جينوم Lambda بأكمله تقريبا ، باستثناء الأزواج الأساسية الخمسة الأولى ، لهذا الفيروس التمثيلي. فيما يلي مؤامرة GC للفيروس الفردي.

يتم عرض الجينوم المحدد. يوضح هذا الشكل خريطة جينوم لامدا. أخيرا ، يتم عرض رسم خرائط جينوم فيروس واحد للبكتيريا المعزولة والمضخمة التمثيلية لامدا.

يوضح المحور X موضع الجينوم. يوضح المحور Y النسبة المئوية للتغطية. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام تقنية معقمة وأخذ الوقت الكافي لضمان تجنب التلوث.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى لتقييم تصنيف المتغيرات المعزولة قبل تسلسل الجينوم الكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل المتغيرات الفردية باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتضخيم الجينوم الكامل.