العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام 'جينوم فيروس واحد'

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل جسيمات فيروسية مفردة من مجتمعات ميكروبية مختلطة، وتسلسل المادة الجينومية التي تم الحصول عليها لتحديد الفيروسات من بيئات متنوعة دون الحاجة إلى استزراعها. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الجسيمات الفيروسية المفردة باستخدام الفرز بالتدفق الخلوي على حبيبات الآغاروز. ثم يتم التحقق من التقاط الجسيم الفيروسي المفرد بواسطة المجهر البؤري.

بعد ذلك، يتم عزل المادة الجينومية من الجسيمات الفيروسية وتضخيمها باستخدام التضخيم بالإزاحة المتعددة أو MDA لتوليد كمية DNA اللازمة لتسلسل القواعد. وأخيرًا، يتم تحديد تسلسل DNA الفيروسي باستخدام تقنيات الإنتاجية العالية لتوليد تغطية فائضة لجينوم الجسيم الفيروسي، مما يساعد بشكل كبير في تجميع الجينوم وتوصيفه. وفي نهاية المطاف، تتيح تقنيات المعلوماتية الحيوية التي تهدف إلى استخدام مناهج أخذ عينات فرعية من التسلسلات لزيادة حجم القطع المتصلة (contig) تحليل الجسيمات الفيروسية المعزولة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيئة الفيروسية من خلال توفير سياق جينومي للمجموعة الضخمة من جينات العوالق الفيروسية غير المصنفة، فضلاً عن تمكين اكتشاف جينومات جديدة من أنظمة بيئية متنوعة. وبشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن عملية تضخيم وعزل الفيريونات المنفردة تدفع حدود التكنولوجيا الحالية إلى أقصى مداها. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نقيم استخدام MDA على مجتمعات العوالق الفيروسية، وأدركنا أنه من الممكن فرز جسيم فيروسي واحد وتسلسله، وبالتالي تجميع جينوم فيروسي كامل من هذه المجتمعات المعقدة. لفرز الفيروسات باستخدام مقياس التدفق الخلوي المجهز بأنابيب مضاعفة ضوئية مخصصة للتشتت الأمامي أو FSCPMT. ابدأ بتخفيف الجسيمات الفيروسية في tris-EDTA المرشح بمرشح 0.1 ميكرون. بالنسبة للمجموعة المختلطة التي تحتوي على جسيمات T4 وعاثيات lambda، اضبط FSCPMT على 1000 وSSC على 200 لتحقيق أقصى قدر من نسبة الإشارة إلى الضوضاء.

بعد تشغيل عينات الضبط، قم بتشغيل حوالي 100 µL من المعلق الفيروسي المصبوغ حتى الوصول إلى إجمالي 5,000 حدث. ثم استخدم مخططات sybr green one وFSCPMT لوضع بوابة ضيقة في مركز الجسيمات الفيروسية. الآن أضف خمسة µL من agarose بنسبة 1% منخفض درجة الانصهار في محلول TBE المنظم المبرد إلى 37 °C إلى كل بئر على شريحة مجهر P-T-F-E، ثم قم بتحميل الشريحة في جهاز قياس التدفق الخلوي لالتقاط الجسيمات الفيروسية المفروزة.

ابدأ عملية الفرز، مع التقاط 10 أحداث لجزيئات فيروسية أو أكثر في بعض الآبار للمساعدة في تحديد عمق الفيروسات أثناء المجهر الماسح الليزري البؤري. عند اكتمال الفرز، قم بإزالة الشريحة من جهاز قياس التدفق الخلوي وأضف خمسة ميكرولترات إضافية من أغاروز منخفض درجة الانصهار المبرد إلى 37 °C إلى كل بئر يحتوي على الجزيئات الفيروسية. بالنسبة للفيريونات المنفردة، اضبط المجهر الماسح الليزري البؤري على إثارة بطول موجي 488 nanometers. ثم قم بتصوير الجزيئات المدمجة باستخدام عدسة شيئية ذات مسافة عمل طويلة 63x للتحقق من وجود جزيء واحد فقط وعدم تكدس عدة فيروسات فوق بعضها البعض. وبمجرد تحديد الآبار التي تحتوي على فيروسات منفردة، استخدم شفرة حلاقة لإزالة خرزات الأغاروز المطلوبة من الشريحة ووضعها في أنبوب PCR معقم.

ضع الأنبوب في الكتلة الحرارية لجهاز التدوير الحراري المضبوط على 94 °C لمدة ثلاث دقائق لتحليل الجسيمات الفيروسية في موقعها. بعد ذلك، وبعد إجراء عملية MDA معدلة، انقُل الحمض النووي الجينومي إلى أنابيب Eppendorf سعة 1.7 milliliter وأضف عُشر حجم من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 molar في محلول TBE المنظم لتنقية المادة الجينومية المُضخمة. ضع العينات عند 55 °C لمدة 10 دقائق لإذابة الأغاروز، ثم انقل الأنابيب إلى 42 °C لخفض درجة الحرارة قبل إضافة الإنزيم. الآن، أضف وحدتين من Beta-agarase إلى كل أنبوب واحضن الأنابيب لمدة ساعتين.

ثم أضف حجماً واحداً من محلول الفينول المشبع والمُنظم إلى كل أنبوب. اخلط المزيج بقوة ثم قم بطرد مركزي للأنابيب لمدة 15 دقيقة عند 3,500 ×g في درجة حرارة الغرفة. انقل الطافات التي تحتوي على الـ DNA إلى أنبوب Eppendorf جديد سعة 1.7 ملليلتر. بعد ذلك، أضف حجماً واحداً من الإيزوبروبانول بتركيز 100% وميكرولتر واحد من الـ glyco-blue إلى الأنابيب، واقلب الأنابيب للمزج. بعد إجراء عملية الطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى، وهذه المرة لمدة 60 دقيقة عند 28,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C، قم بسحب الإيزوبروبانول مع الحرص على عدم تحريك الراسب، وأضف 150 ميكرولتر من الإيثانول بتركيز 70% إلى كل أنبوب. قم بدوران الأنابيب لمدة 10 دقائق عند 28,000 ×g في درجة حرارة الغرفة. اسحب الإيثانول، وجفف راسب الـ DNA بالهواء، ثم أعد تعليق الـ DNA في حجم مناسب من محلول tris-EDTA المنظم. يوضح هذا الإعادة البنائية ثلاثية الأبعاد لجسيم فيروسي مصبوغ بـ sybr green 1 داخل خرزة أغاروز كيف يمكن استخدام المجهر الليزري البؤري لتصور وتأكيد الحصول على فيريون واحد في كل بئر بعد التقاطه وتضمينه في الأغاروز، ويظهر الشكل المدرج تكبيراً أعلى للجسيم الفيروسي المعزول.

يظهر هنا مخطط ملف الفلورة النسبية لجسيم فيروسي واحد مصبوغ داخل خرزة أغاروز. وتوضح هذه السلسلة النهائية من الأشكال كيف تم استعادة معظم جينوم Lambda بالكامل، باستثناء الأزواج القاعدية الخمسة الأولى، لهذا الفيروس الممثل. ويظهر هنا مخطط GC للجينوم الفيروسي الواحد الذي تم تحديده. ويوضح هذا الشكل خريطة جينوم lambda. وأخيراً، يظهر رسم خرائط لجينوم فيروس واحد للعث البكتيري lambda المعزول والمضخم الممثل. يوضح المحور X موقع الجينوم، بينما يوضح المحور Y نسبة التغطية.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام تقنية التعقيم وتخصيص الوقت الكافي لضمان تجنب التلوث. عقب هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى لتقييم تصنيف الفيريونات المعزولة قبل إجراء تسلسل الجينوم الكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل الفيريونات المفردة باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة، والمجهر البؤري، وتضخيم الجينوم الكامل.