مع تدبير هيدروجيل Bilayered التحكم ASC التمايز

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مصفوفة مركبة مصنوعة من مواد حيوية طبيعية يمكن استخدامها لتوصيل الخلايا الجذعية وتمييزها للمساعدة في التئام الجروح. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون أولا أو SC من اختبار. بعد ذلك ، يتم تحميل A SC على كريات شيتوزان المجهرية المعدة مسبقا.

ثم يتم صب جل الكولاجين الليفي ، ويتم وضع حبات A-S-C-C-S-M فوق هلام الكولاجين. أخيرا ، يتم صب جل الفيبرين PEG فوق جل الكولاجين A-S-C-C-S-M ، ويضاف الوسط. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الهجرة المتزامنة ثنائية الاتجاه ل A SC من حبة CSM إلى كل من مصفوفات الفيبرين الكولجين و PEG.

من خلال هذا الإجراء ، يمكن لمصدر واحد للخلايا الجذعية أن يأخذ إشارات تفاضلية من البيئات الدقيقة للكولاجين والفيبرين PEG ، ويصبح محفزا تفاضليا لإنتاج عوامل متعددة الاتجاهات وتشكيل شبكة من هياكل ما قبل الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المواد المركبة أحادية المواد أو بدائل الجلد منزوعة الخلايا ، هي أن هذه المنتجات الأخرى لا تعالج بنشاط إعادة توعية المنتج من قبل المضيف. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن RAD A SE المعزول لديه ميل للتمييز نحو النمط الظاهري الوعائي عند زراعته في مصفوفة فيبرين الخنزير.

أثارت هذه الملاحظة فكرة أنه يمكن استخدام مصدر واحد للخلايا الجذعية في وقت واحد في نظام يتكون من مواد حيوية مختلفة أخرى. بعد عزل واستزراع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون أو ASCs ، وإعداد كريات شيتوزان المجهرية أو CSMs وتحميل ASCs في CSMs ، قم بإعداد البولي إيثيلين جلايكول ، هيدروجيل الفيبرين عن طريق إذابة الوتد المعدل للسكسينيل المشتقة من الدهون في أربعة ملليلتر من محلول ملحي مخزن في tris. قبل التجربة مباشرة ، استخدم مرشحا 0.22 ميكرون لتعقيم المحلول.

في بئر استزراع من مزيج من ستة ألواح آبار ، يتم احتضان 500 ميكرولتر من مخزون الفيبرينوجين و 250 ميكرولتر من مخزون PEG لمدة 20 دقيقة في حاضنة مرطب بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بخلط 250 ميكرولترا من A-S-C-C-S-M المحضر مسبقا مع محلول الفيبرينوجين pegylated ، وأضف على الفور ملليلترا واحدا من محلول مخزون الثرومبين وباستخدام ماصة سريعة المعدل الثلاثي مرة أو مرتين على الفور ضع خليط هلام الخلية في صفيحة 12 بئر واحتضانها في غرفة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الفيبرين الناتج مرتين باستخدام HBSS واحتضانه بوسط ألفا الحد الأدنى الأساسي المكمل بنسبة 10٪ FBS في حاضنة مرطب بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية باستخدام تقنيات المجهر الضوئي القياسية على مدى 11 يوما.

لاحظ هجرة الخلايا من CSM إلى مزيج الهلام ، A-S-C-C-S-M مع الكولاجين من النوع الأول المستخرج من أوتار ذيل الفئران باستخدام اثنين من هيدروكسيد الصوديوم العادي. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.8 والليف. أضف خليط الكولاجين الليفي ، A-S-C-C-S-M إلى طبق 12 جيدا واحتضنه في حاضنة مرطب بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد التحقق من اكتمال الرجفان ، احتضن المواد الهلامية المصنوعة من الكولاجين A-S-C-C-S-M لمدة تصل إلى 11 يوما في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. مراقبة هجرة الخلايا من CSM إلى الجل على مدى 11 يوما باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية لتطوير بنية الطبقة الثنائية لدراسة خصائص الهجرة والحث المشترك لمصدر واحد من الخلايا الجذعية. باستخدام سقالتين حيويتين.

قم بإعداد كل من الكولاجين والمواد الهلامية PEG fibrin مع التعديلات الطفيفة التالية ، وقم بإعداد مليلتر واحد من 7.5 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجين. ثم انقل الخليط إلى إدراج ثقافة الأنسجة بستة آبار واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الرجفان الكامل ، ضع على سطح الكولاجين ، 200 ميكرولتر من خمسة ملليغرام من A-S-C-C-S-M في وسط الاستزراع.

بعد أن تستقر الكريات المجهرية فوق الجل ، قم بإعداد جل الفيبرين PEG باستخدام 250 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا. ثم ضع طبقة من محلول الثرومبين الفيبرينوجين المبتذل فوق طبقات الكولاجين A-S-C-C-S-M. بمجرد الانتهاء ، احتضان التركيبات لمدة 30 دقيقة في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لتحقيق اكتمال.

أخيرا ، ضع ملليلترا واحدا من الوسط في الغرفة العلوية فوق البناء وثلاثة ملليلتر من الوسط في الغرفة السفلية. كشف توصيف SC المضمن في هذه السقالة أنه يمكن وضع CSMs المحملة ب SC بين طبقة من الكولاجين وفيبرين الوتد في وقت واحد وأخذ إشارات تفاضلية من كلتا البيئتين خارج الخلية لتزدهر في ظل ظروفها الجديدة. كما هو موضح هنا ، دعم الكولاجين قدرة ASCs على البقاء خلايا جذعية كما يتضح من تعبيرها عن stro one باللون الأخضر ، بالإضافة إلى مورفولوجية الخلايا الليفية.

في المقابل ، حث PEG fibrin ASCs على التمايز نحو النمط الظاهري اللاوعائي كما يتضح من مورفولوجيا تشبه الأنبوب الموضح هنا ، مع استكمال التجويف والتعبير الخاص بالخلية البطانية الخاصة بها لعامل von Willow Brandand الموضح هنا باللون الأحمر. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو موضح هنا ، يبدو أن هذه الأنماط الظاهرية المرصودة تحدث في وقت مبكر من الثقافة وتم الحفاظ عليها على مدار 11 يوما. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من الفئران ، وتحميلها على الكيتو والكريات المجهرية ، ودمجها في هيدروجيل ثنائي الطبقة باستخدام مواد حيوية معتمدة من إدارة الغذاء والدواء.

لا تنس أن المواد الحيوية والخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول مشتقة من والبشر ويمكن أن تكون شديدة الخطورة إذا كانت ملوثة بمسببات الأمراض من مضيفها. ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية الشخصية وتقنيات زراعة الخلايا المعقمة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.