سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

الهدف العام من هذه المنهجية هو إنشاء هيدروجيلات كبيرة المسامية بأحجام مسام مختلفة لتطبيقات زراعة الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مثل الجدوى الأساسية لمادة هيدروجيل جديدة لتطبيقات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه المنهجية هي أنها تقدم مجموعة من التقنيات لتحسين وضبط مادة جديدة وفقا لمتطلبات أنواع مختلفة من الخلايا.

للبدء ، قم بتخفيف ملليغرام واحد من ببتيد RGD أو ببتيد لاصق خلية مكافئ في 100 ميكرولتر من الماء المعقم للحصول على محلول 10 ملليغرام لكل مليلتر. بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء السفلي من لوح 96 جيدا واستبدله بغلاف بلاستيكي للإزالة. امزج 100 ميكرولتر من محلول مخزون BSA و 100 ميكرولتر من محلول مخزون THPC في لوح البئر 96 للحصول على 200 ميكرولتر من الهيدروجيل.

امزج المكونات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل لضمان هيدروجيل موحد بعد البلمرة. ضع طبق 96 جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم بلمرة جميع الهلاميات المائية بشكل صحيح. بعد البلمرة ، قم بإزالة الغلاف البلاستيكي بعناية وببطء من قاع اللوحة.

اضغط على الهلاميات المائية من لوحة البئر 96 باستخدام طعنة صغيرة وانقلها إلى أنابيب 1.5 مليلتر مع PBS معقم الرقم الهيدروجيني 7.4. قم بتخزين الهلاميات المائية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر. لتجفيف الهلاميات المائية بالتجميد ، املأ أولا أنابيب سعة 1.5 مليلتر ب 500 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع الأيونات وقم بإزالة الأغطية.

انقل الهلاميات المائية إلى أنابيب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر باستخدام الملقط. لف الأنابيب سعة 1.5 ملليلتر بإحكام بغشاء البارافين باستخدام ثلاث طبقات على الأقل لكل قارورة. استخدم إبرة لثقب ثقوب صغيرة في الفيلم لتمكين إطلاق الغاز من الأنابيب.

لضمان تجميد الماء والهيدروجيل تماما ، انقل القارورة إلى محلول النيتروجين السائل لمدة خمس دقائق. مباشرة بعد إزالتها من النيتروجين السائل ، انقل القوارير إلى مجفف التجميد لمنع ذوبان المواد. كخطوة تجميد بديلة ، احتفظ بالقوارير عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل لتجميد الهلاميات المائية ببطء.

مباشرة بعد الإزالة من درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، انقل القوارير إلى مجفف التجميد لمنع ذوبان المواد. بعد 24 ساعة والتبخر الكامل للماء داخل الهيدروجيل وحوله ، قم بإذابة المادة عن طريق إزالتها من مجفف التجميد. لترشيح الجسيمات ، امزج مكونات الهيدروجيل كما كان من قبل.

بعد الخلط ، أضف كلوريد الصوديوم على الفور حتى يحدث التشبع. أضف الملح حتى يمكن رؤية بلورات الملح في المحلول على شكل راسب أبيض. يمكن تغيير أحجام المسام عن طريق طحن بلورات الملح قبل الاستخدام.

انقل لوحة البئر 96 إلى شاكر ورجها حتى تتم البلمرة. بعد حوالي 10 دقائق ، قم بإزالة الهلاميات المائية من الطبق كما كان من قبل. احتضان الهلاميات المائية لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة في ماء معقم على دوار لتصفية كل الملح من قالب الهيدروجيل.

قم بتخزين الهلاميات المائية عند أربع درجات مئوية في PBS لمدة تصل إلى عدة أشهر. لتكوين لطيف ، قم بإعداد الهلاميات المائية كما هو موصوف. ثم قم بإزالة الهيدروجيل من المحلول باستخدام كماشة.

قم بإزالة الماء الزائد بورق عالي الامتصاص وضعه فوق كتلة من الثلج الجاف. قم بتجميد الهيدروجيل لمدة 30 ثانية وإزالته بعناية من الكتلة. لا تتلف الهيدروجيل.

استخدم ملعقة بعناية لكشطها من الكتلة. انقل الهيدروجيل إلى أنبوب سعة 1.5 مل وجففه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد محلول مخزون Rhodamine B بالإضافة إلى التخفيفات التسلسلية كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإزالة الهيدروجيل من المحلول المخزن وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر مع مليلتر واحد من 0.01 ملليغرام لكل مليلتر من محلول الرودامين B. قم بتلطيخ الهيدروجيل طوال الليل في محلول Rhodamine B في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، انقل الهيدروجيل الذي سيتم تصوره إلى 10 مل من PBS واغسله لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

قطع شرائح صغيرة من الهيدروجيل باستخدام شفرة. ثم انقل الهيدروجيل إلى شريحة مجهرية بثمانية آبار وقم بتغطيتها ب PBS. باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، تصور الهيدروجيل بطول موجي 514 نانومتر.

قم بتصفية معقمة لجميع محاليل المخزون بفلتر 0.45 ميكرون. ابدأ في تحضير الهيدروجيل وقم بتضمين الببتيد اللاصق للخلية قبل بلمرة الهيدروجيل. بعد خلط المكونات ، قم بتقطيع الخليط على الفور إلى شريحة مجهرية من ثمانية آبار حتى يتم تغطية الجزء السفلي بالكامل.

انقل الخلايا إلى وسط زراعة خلايا DMEM معقم مسبقا مكمل بمصل الأبقار الجنيني والبنسلين ستربتومايسين ومحلول الأحماض الأمينية غير الضروري. بعد عد الخلايا بغرفة عد Neubauer ، قم بعمل ماصة بعناية 200 ميكرولتر من العدد المطلوب من الخلايا على سطح الهيدروجيل. قم بتغطية الشريحة المجهرية الثمانية بغطاء ونقلها إلى حاضنة.

بعد أربع ساعات على الأقل من التعلق الخلوي ، اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من PBS لثقافة الخلايا المعقمة. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واغسلها مرتين باستخدام PBS. قم باختراق الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X لمدة خمس دقائق قبل غسلها مرتين أخريين باستخدام PBS.

تلطيخ الخلايا بالتولودين رودامين عن طريق خلط خمسة ميكرولترات من مخزون الميثانول مع 195 ميكرولتر من PBS وإضافته إلى الخلايا في درجة حرارة الغرفة. قم بتلطيخ الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام قبل غسلها مرتين باستخدام PBS. تحقق من خصائص التصاق الخلية باستخدام مجهر متحد البؤر عند 514 نانومتر.

تحليل خصائص الهيدروجيل كما هو موضح في بروتوكول النص. كما هو موضح هنا ، فإن الهلاميات المبلمرة والملطخة ليس لها بنى مميزة. بعد تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد في درجات حرارة مختلفة ، يمكن تمديد متوسط حجم المسام داخل الهيدروجيل حتى 60 ميكرون.

ينتج عن ترشيح الملح شبكات موحدة بأحجام مسام تبلغ حوالي 10 ميكرون. يمكن تعديل الحجم بشكل أكبر عن طريق طحن بلورات الملح قبل الاستخدام. يؤدي استخدام نهج التجميد المتدرج على كتلة من الجليد الجاف إلى تكوين قنوات يبلغ قطرها حوالي 20 ميكرون وطولها عدة مئات من الميكرون.

قبل الوظيفة مع الجزء اللاصق للخلية ، لا يمكن للخلايا أن تلتصق بسطح الهيدروجيل وتظهر مورفولوجيا مستديرة. فقط بعد تزويد المادة بالببتيد اللاصق للخلية ، تجد الخلايا نقاط التصاق بؤرية تتيح الالتصاق المناسب للخلية بالمادة. هذا أمر بالغ الأهمية لاستخدام مواد جديدة في تطبيقات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة بنية الهيدروجيل بطرق بسيطة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على معظم أنظمة الهيدروجيل الجديدة للتعرف على الاستخدام في زراعة الخلايا وتحسين بنية الهيدروجيل اعتمادا على الاستخدام المقصود.