الفشوت القوارض تقييم النسخ المتماثل وظيفة خلايا بيتا في Adenovirally-transduced المعزولة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مسارات الإشارات التي تنظم التغيرات في كتلة خلايا بيتا الوظيفية. يتم تحقيق ذلك في ثقوب الفئران المعزولة عن طريق الإفراط في التعبير عن الجين أو قمعه باستخدام نواقل الفيروسات الغدية. بعد هذا التلاعب ، يتم تقييم وظيفة خلايا بيتا عن طريق إفراز الأنسولين وتكاثر العيينة المقاسة عن طريق دمج الثايميدين الترتيتيتي.

في النهاية ، يمكن أن تظهر هذه المقايسات ما إذا كان الجين ذي الأهمية ينظم تكاثر خلايا بيتا أو يعمل في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الجفن ، مثل هل يؤثر مكون معين من مسار الإشارات على نمو خلايا بيتا ووظيفتها؟ قم بإعداد صفيحة مطلية بستة آبار غير مزرعة الأنسجة عن طريق إضافة ملليلترين من الوسائط المعدلة إلى العدد المطلوب من الآبار.

على سبيل المثال ، قد تتطلب التجربة النموذجية ثلاثة آبار ، واحدة لكل منها للتحكم في الفيروسات ، ومكافحة الفيروسات ، وتقوم المجموعة التجريبية بتسخين اللوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة على الأقل. مباشرة بعد عزل ثقب الفئران ، ضع واحدة إلى 200 ثقب في كل بئر من اللوحة المعدة. سيتم استخدام 60 ثقبا في المقايسات الكيميائية الحيوية ويمكن استخدام الثقوب المتبقية للتعبير الجيني أو الدراسات أو النشاف المناعي لتورم اللوحة برفق لإحضار الثقوب إلى وسط كل منها.

حسنا ، ثم قم على الفور بماصة الفيروس الغدي مباشرة على الثقوب. في وسط الطبق. استخدم من واحد إلى 500 مضاعف من العدوى اعتمادا على فعالية الفيروس الغدي في الإفراط في التعبير عن البروتين الذي يثير اهتمامك أو إسقاطه.

الاختراق الفعال للفيروسات الغدية في قلب الجفن من اتساق النتائج. تحويل الجفون مباشرة بعد الجفن. العزلة ضرورية.

لا تزعج اللوحة لمدة خمس دقائق ، ثم انقلها إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وقم بتورم الثقوب برفق إلى مراكز الآبار. انقل الثقوب إلى بئر جديد يحتوي على وسائط جديدة باستخدام ماصة صغيرة سعة 200 ميكرولتر.

إذا أصبحت الثقوب متصلة باللوحة ، فيمكن إزاحتها برفق باستخدام طرف الماصة. من المفيد استخدام فيروس تحكم يعبر عن GFP للتحقق من كفاءة النقل الكافية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصور تغلغل الفيروس الغدي في الثقافة الأساسية للجزيرة. الجزر الصغيرة لمدة يوم إلى ثلاثة أيام أخرى ، وتغيير وسائل الإعلام يوميا.

يجب تحسين وقت الثقافة من خلال الدراسات التجريبية ويختلف بناء على الأهداف التجريبية. خلال ال 24 ساعة الأخيرة ، قم بدمج الثايميدين الترتيتيب في الوسائط بتركيز ميكرو كوري واحد لكل ملليمتر من الوسائط. قم أولا بإعداد 50 مل من SAB العامل حديثا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتسخينه في حمام مائي 37 درجة مئوية.

ماصة 10 ملليلتر من SAB العامل في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وإضافة 66.8 ميكرولتر من 2.5 مولار D الجلوكوز. لتحضير SAB عالي الجلوكوز ، أضف 44.8 ميكرولتر من 2.5 monolo D glucose إلى 40 مل المتبقية من SAB العامل. لتحضير SAB منخفض الجلوكوز ، قم بتسمية ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.7 مل.

لكل بئر من لوحة الآبار الستة وأضف ملليلتر واحد من PBS إلى كل أنبوب. لا تنس اتباع البروتوكولات المؤسسية للتعامل مع الثقوب المشعة والتخلص منها. باستخدام منظار مجسم أو مجهر قياسي ، حدد وانقل 20 ثقبا بحجم مماثل إلى كل أنبوب طرد مركزي صغير.

على سبيل المثال ، قد يحتوي كل أنبوب على خمس ثقوب صغيرة و 10 متوسطة وخمس ثقوب كبيرة الحجم. على الرغم من أن النتائج يتم تطبيعها إلى إجمالي محتوى البروتين في نهاية التجربة ، إلا أنه من الأهمية بمكان أن يتطابق الحجم مع الثقوب بين المجموعات. بعد السماح للثقوب بالاستقرار في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية أو عن طريق الطرد المركزي ، قم بالشفط ووزن PBS بماصة صغيرة ثم تابع تحضير الثقوب للمقايسات الكيميائية الحيوية.

لتحضير الثقوب لمقايسة إفراز الأنسولين ، يجب أولا تحضينها مسبقا ب SAB منخفض الجلوكوز. للقيام بذلك ، أضف 400 ميكرولتر من SAB منخفض الجلوكوز إلى الأنابيب وضعها بأغطية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 60 دقيقة بعد ساعة ، قم بشفط ما قبل الحضانة منخفض الجلوكوز SAB لقياس إفراز الأنسولين القاعدي. كرر إجراء ما قبل الحضانة.

ومع ذلك ، لقياس إفراز الأنسولين المحفز ، استخدم 400 ميكرولتر من SAB عالي الجلوكوز بدلا من SAB منخفض الجلوكوز وكما كان من قبل ، احتضن الثقوب لمدة 60 دقيقة بعد الحضانة في شفط SAB عالي أو منخفض الجلوكوز و SAB للمقايسة المناعية الإشعاعية للأنسولين ، والتي سيتم تنفيذها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم تابع مقايسة دمج الثايميدين باستخدام نفس مجموعة الثقوب. ابدأ بالثقوب المستخدمة للتو في فحص إفراز الأنسولين.

أضف ملليلترا واحدا من PBS واترك الثقوب تستقر عن طريق الجاذبية. ثم استنشق PBS بماصة صغيرة. تجاهل هذه الخطوة وكررها مرة أخرى.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المثلج إلى الثقوب واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي الأنابيب عند أربع درجات مئوية. ثم الشفط ، وتجاهل TCA.

بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولترا من 0.3 هيدروكسيد الصوديوم العادي واحتضن الثقوب لمدة 30 دقيقة من درجة حرارة الغرفة. خلال هذه الحضانة ، قم بدوامة العينات بقوة لمدة خمس إلى 10 ثوان كل 10 دقائق. في موازاة ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من كوكتيل العد الآمن إلى سبعة مليلتر من أنابيب عد التلألؤ السائل.

عندما تنتهي حضانة الثقوب ، أضف 50 ميكرولترا من الثقوب إلى أنبوب التلألؤ. رج الأنبوب المغطى لفترة وجيزة وقم بقياس النشاط الإشعاعي للعينات في عداد تلألؤ سائل. أيضا لقياس تركيز البروتين ، انقل 10 ميكرولترات من الفيلاس إلى اختبار حمض بيونيك تجاري واتبع بروتوكول الشركة المصنعة.

في وقت لاحق أثناء تحليل البيانات ، قم بتطبيع النتائج إلى تركيز البروتين باستخدام البروتوكولات الموصوفة. تكرار العيينة ووظيفة خلايا بيتا. في ثقوب الفئران ، تم تقييم الإفراط في التعبير الفيروسي الغدي عن الجين الافتراضي ، ستة تحفيز بقوة ، تكاثر العيينة دون تغيير وظيفة خلايا بيتا.

زيادة التعبير عن الجين السادس ، وزيادة تخليق الحمض النووي كما تم قياسه عن طريق دمج الثايميدين لأن معظم الخلايا في ثقب الفئران هي خلايا بيتا. يمكن أن تظهر التجارب الإضافية أن هذه الزيادة في دمج الثايميدين ترجع إلى زيادة تكاثر خلايا بيتا. أظهر اختبار إفراز الأنسولين أن الإفراط في التعبير عن الجين السادس لم يغير إحدى وظائف خلايا بيتا الأولية إفراز الأنسولين عند الجلوكوز المنخفض والمرتفع.

تعكس الزيادة في إفراز الأنسولين بتركيزات الجلوكوز المنخفضة والعالية صحة الثقوب بعد العلاج بالفيروس الغدي. إذا كانت زيادة التعبير عن الجين السادس تضعف وظيفة خلايا بيتا ، فمن المحتمل أن ينعكس ذلك على أنه انخفاض في الأنسولين الذي يفرز بتركيزات عالية من الجلوكوز. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تكاثر خلايا بيتا وإفراز الأنسولين لتحديد ما إذا كان هناك جين معين يؤثر على نمو خلايا بيتا أو وظيفتها.