إعداد خطوط الخليوي لضربة قاضية شرطي في التعبير الجيني وقياس تأثيرات ضربة قاضية على الموت الناتج عن خلية E4orf4

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثير الضربة القاضية ACF واحد أو SNF اثنين H على موت الخلايا المستحث E أربعة أو أربعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد خطوط الخلايا التي يتم فيها تنشيط تعبير ACF واحد أو SNF اثنين H srna بشكل مشروط عن طريق إضافة الدوكسيسيكلين مما يؤدي إلى انخفاض مستويات ACF واحد أو SNF اثنين H بروتين كخطوة ثانية. يتم معالجة خلايا خطوط الخلايا التي تم الحصول عليها بالدوكسيسيكلين لتقليل تعبير ACF واحد أو SNF اثنين H أو تركها دون علاج.

بعد ذلك ، يتم التعبير عن E ، أربعة أو أربعة في الخلايا مع أو بدون S-H-R-N-A ، مقاومة ACF واحد أو SNF ، اثنان H.In من أجل التحقيق في تأثير ACF واحد أو SNF اثنين H على E ، يتم الحصول على أربع أو أربع نتائج موت الخلايا المستحثة التي تظهر تأثير ACF واحد أو SNF اثنين من مستويات H على E أربعة أو أربعة سمية بناء على عد النواة ذات التشكل موت الخلايا المبرمج باستخدام مقايسة JY. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل التعداء العابر للحمض النووي الريبي ، هي أن جميع الخلايا تعبر عن S-H-R-N-A والنسبة المئوية للخلايا التي تعبر معا مع البلازميد التقليدي أعلى. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للآليات الكامنة وراء موت الخلايا الناجم عن 4 0 4 ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على دراسة البروتينات البروتينية الأخرى.

بالإضافة إلى آنا لافي ، سيقوم باحث من مختبري بعرض أجزاء من هذا الإجراء لبدء إجراء توليد خطوط الخلايا المحفزة لوحة T-Rex 2 9 3 خلايا بكثافة حوالي خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل صفيحة 10 سنتيمترات في ثمانية ملليلتر من DMEM المحتوي على مصل بدون التتراسيكلين ومع خمسة ميكروغرامات من المللي من الناسف جانبا في احتضان الألواح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي. استبدل الوسط بثمانية ملليلتر من الوسط الطازج قبل التعداد. البلازميد للتعداء هو بلازميد P superior neo plus GFP في تشفير ACF واحد أو SNF اثنين H-S-H-R-N-A ، مدفوعا بمحفز H واحد محفز للتتراسيكلين ، بالإضافة إلى جين مقاومة النيومايسين الذي يدمج GFP ويقوده محفز PGK التأسيسي.

أضف 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 500 ميكرولتر من 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم والدوامة. ثم أضف كاشف PY النفاث عند ميكرولترين لكل ميكروغرام من الحمض النووي إلى أنبوب آخر يحتوي على 500 ميكرولتر من 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم والدوامة. أضف محلول الفطيرة النفاثة إلى الحمض النووي واخلطه جيدا عن طريق الدوامة.

احتضنها درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، قم بتقطيع مجمعات الحمض النووي برفق على ألواح 10 سم تحتوي على التقاء 70 إلى 80٪. T-Rex 2 9 3 خلايا مزيج في اليوم التالي.

استبدل الوسط بوسط انتقائي في هذا المثال DMEM كما كان من قبل ، يحتوي على 500 ميكروغرام لكل ملليلتر من G أربعة 18. خلال الأسبوعين المقبلين ، راقب الخلايا. استبدل الوسط الانتقائي بوسط طازج مماثل كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تظهر المستعمرات.

حدد المستعمرات بالعين وحدد موقعها في الجزء السفلي من اللوحة باستخدام علامة ملونة. تحقق تحت المجهر من أن المستعمرات مفصولة جيدا. يمكن عزل المستعمرات بمجرد أن تصبح كبيرة بما يكفي لتصورها بدون مجهر.

لنجاح هذا الإجراء ، من المهم اختيار مستعمرات منفصلة جيدا أثناء عزل المستعمرة. في غطاء معقم ، استنشق الوسط من اللوحة. اشطفها برفق باستخدام PBS واستنشق جيدا كل السوائل المتبقية.

أضف ثلاثة ميكرولترات من 0.25٪ من الرحلات في EDTA إلى مستعمرة واحدة على اللوحة عن طريق الأليفة ، والرحلات بشكل متكرر حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة. انقل الخلايا إلى وسط انتقائي في بئر في طبق 24 بئر. كرر هذا للعديد من المستعمرات الأخرى على اللوحة.

تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تملأ البئر. ثم قم بتقسيم الخلايا من كل مستعمرة أصلية إلى ثلاثة آبار كل منها في صفيحة منفصلة من 12 بئر واحتضانها طوال الليل في اليوم التالي. استبدل الوسط الموجود في صفيحة واحدة بوسط يحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر دوكسيسيكلين من محلول مخزون محضر في ماء مقطر مزدوج.

استبدل الوسيط في لوحة التحكم بوسط بدون دوكسيسيكلين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. ثم يتم حصاد الخلايا من بئر واحد معالج وآخر غير معالج لتحليل اللطخة الغربية لتحديد كفاءة ACF واحد أو SNF اثنين H تم إسقاطها ، وتظهر نتيجة تمثيلية هنا.

كانت هذه البقعة ملطخة بالأجسام المضادة ل SNF two H و alpha tubulin. هذا الأخير بمثابة عنصر تحكم في التحميل اثنين من المستنسخة. أظهر الرقم أربعة والرقم خمسة انخفاضا قويا في SNF اثنين H عند تحريض الدوكسيسيكلين ، وبالتالي يتم اختيارهما للاستخدام في تجربة الضربة القاضية ، والتي سيتم توضيحها في الجزء التالي.

سيتم استخدام الخلايا غير المعالجة في اللوحة الثالثة لتوسيع خط الخلايا المحدد وسيتم تجميد حصص تلك الخلايا لاحقا. لمزيد من الاستخدام للحث على ضربة قاضية من خلية ACF واحدة أو SNF اثنين من خلايا H في وسط انتقائي في ألواح 10 سم ، أضف الدوكسيسيكلين بمعدل ميكروغرام واحد لكل مليلتر إلى نصف الألواح واحتضان 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة. يجب أن توفر كل مجموعة من اللوحات الخلايا ل 12 لوحة بحجم ستة سنتيمترات ، بما في ذلك نسختان مكررتان لمقايسة DPI لكل نقطة ، بالإضافة إلى لوحة واحدة لتحليل اللطخة الغربية لكل عينة.

بعد 48 إلى 72 ساعة من الحث ، أنف التربسين ، أنف الخلايا من كل مجموعة من الخلايا وبعد عدها ، 1.5 مرة 10 إلى ست خلايا لكل لوحة ستة سنتيمترات في نفس الوسط مع أو بدون الدوكسيسيكلين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا. كما هو موضح.

يتم نقل كل من الخلايا غير المعالجة والمعالجة بالدوكسيسيكلين في ثلاث نسخ بأربع طرق. واحد مع بلازميد فارغ وبلازميد يعبر عن GFP اثنان مع البلازميد الفارغ بالإضافة إلى ناقل يعبر عن ACF المقاوم ل SHRA واحد GFP أو SNF اثنين HGFP ثلاثة مع بلازميد يشفر E أربعة أو أربعة وبلازميد يعبر عن GFP ومع بلازميد يشفر E أربعة ، كل الأربعة. والمتجه الذي يعبر عن مقاومة SHRA ACF واحد GFP أو SNF اثنين HGFP بعد التعدي يحتضن جميع الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي لتعداء الخلايا ، استخرج البروتينات من صفيحة واحدة لكل عينة لتحليل اللطخة الغربية لتحديد أن ACF واحد أو SNF اثنين H قد تم إسقاطه بكفاءة وأن E أربعة أو أربعة تم التعبير عنها بالتساوي في العينات المختلفة. سيتم استخدام اللوحات ال 16 المتبقية لاختبار DPI. استنشق الوسط من الألواح المخصصة لفحص DPI واغسل الخلايا برفق باستخدام PBS في غطاء كيميائي.

أضف ملليلتر واحد من 4٪ بارا فورمالديهايد المحضر في PBS لتغطية الخلايا وتحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز. استنشق بارا فورمالديهايد واغسله بهز PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. كرر الغسيل مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات بعد غسل PBS الثالث عند 80٪ من الإيثانول المحفوظ عند 20 درجة مئوية تحت الصفر واحتضانه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة على الأقل.

قم بشفط الإيثانول وغسل الخلايا مرتين مع رج PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق في كل مرة بعد ذلك الغسيل مرة واحدة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع PBS التي تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.05٪ بين 20 أو P-B-S-B-T. أيضا مع الاهتزاز لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. قم بسد الخلايا في مليلتر واحد من المخزن المؤقت P-B-S-B-T الذي يحتوي على 10٪ مصل الماعز لمدة 20 دقيقة أثناء الرج في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الخلايا مرتين في P-B-S-B-T خمس دقائق لكل غسلة. احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأساسي ، وهو جسم مضاد E أربعة أو أربعة محددين في هذه الحالة في مليلتر واحد من P-B-S-B-T لمدة ساعة واحدة أثناء هز درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل مرتين في P-B-S-B-T ومرة واحدة في PBS تحتوي على 0.1٪ BSA وخمس دقائق لكل غسلة.

بعد ذلك ، أضف إلى الخلايا ملليلتر واحد من PBS 0.1٪ BSA يحتوي على الجسم المضاد الثانوي المناسب المسمى بالفلورسنت و 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر. يحتضن التركيز النهائي ل DPI لمدة 40 دقيقة أثناء الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أخيرا ، اغسلها باستخدام PBS لمدة خمس دقائق.

جفف البئر عن طريق الشفط واحتفظ بالألواح رأسا على عقب لمدة ساعة إضافية إلى ليلة وضحاها لتحقيق التجفيف الكامل وتغطيتها بشرائح غطاء مثبتة برقائق الألومنيوم على الخلايا باستخدام محلول Flora Mount G. احتفظ بالأطباق عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى تصبح جاهزة للعد. تم إصلاح خلايا النوى المبرمج التي خضعت للعلاجات المختلفة الموضحة في البروتوكول وتلطيخها ب E ، وأربعة أو أربعة أجسام مضادة محددة و DPI لتصور نوى الخلايا المنقولة.

يوضح هذا الشكل مثالا على الخلايا التي تعبر عن E أربعة أو أربعة وتظهر لوحة GFP A التحكم في تعبير بروتين GFP وحده ، وتظهر اللوحة B E أربعة أو أربعة نوى صبغة DAPI تظهر في اللوحة C وتظهر الصور المدمجة في اللوحة D. علامة الأسهم البيضاء ، GFP و E.أربع أو أربع خلايا منقولة تحتوي على نوى ذات مورفولوجيا موت الخلايا المبرمج. تشير الأسهم الحمراء إلى النوى ذات الأشكال غير المنتظمة التي لا يتم احتسابها على أنها نوى موت الخلايا المبرمج ، وعلامة النجمة ، والنوى الانقسامية أو النوى التي قسمت للتو عدد النوى المكثفة أو المجزأة التي تصورها DAPI. تم حساب التلوين لحساب النسبة المئوية للنوى ذات مورفولوجيا موت الخلايا المبرمج داخل مجموعة الخلايا المنقولة للحفاظ على الموضوعية المثلى للاختبار.

تم إجراء عد النواة موت الخلايا المبرمج في العينات المختلفة بطريقة عمياء حيث لم يكن الشخص الذي يقوم بالعد على دراية بهوية العينة تظهر نتيجة تمثيلية في هذا الرسم البياني. لوحظت نسب أعلى من التشوهات النووية في E أربع أو أربع خلايا معبرة تؤكد أن T أربعة أو أربعة تؤدي إلى موت الخلايا. لوحظت أعلى نسبة مئوية من التشوهات النووية في E أربع أو أربع خلايا معبرة حيث تم تقليل مستويات ACF واحد بواسطة SHR وضربة قاضية بوساطة تشير إلى أن ACF واحد يعزز موت الخلايا Inge أربعة أو أربعة سمية E أربعة أو أربعة في الخلايا.

ينتج التعبير عن مستويات منخفضة من ACF واحد عن زيادة في E أربعة أو أربعة مستويات كما هو موضح في اللطخة الغربية. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسهيل النصيحة في عد دعامة نواة موت الخلايا المبرمج باستخدام DPI وتطبيق معايير صارمة لتحديد هذه النواة. بالإضافة إلى هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل المقايسات الجينية للنسيل للتحقق من صحة نتائج DA pse بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الترسيب المناعي المشترك للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال ، ما إذا كان هناك تفاعل جسدي بين البروتينات التي تم فحصها.