كله جبل RNA نيون في الموقع التهجين من ذبابة الفاكهة الأجنة

يصف هذا الإجراء طريقة أسماك محسنة لتقييم ميزات التعبير والتوطين للحمض النووي الريبي في أجنة ذبابة الفاكهة بأكملها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع مسبار الحمض النووي الريبي المسمى أولا ، مكملا للمستر NA أو الحمض النووي الريبي غير المطلي ذي الأهمية عن طريق النسخ المختبري لقالب DNA محدد بشكل مناسب. في موازاة ذلك ، يتم استخدام أقفاص السكان للذباب لحصاد وإصلاح وتجارتي الأجنة في مرحلة النمو المرغوبة.

بعد عدة خطوات تثبيت لاحقة ، يتم تهجين الأجنة باستخدام مسبار الحمض النووي الريبي المضاد للحساس. أخيرا ، بعد الغسيل المكثف للعينات ، يتم الكشف عن المسبار المهجن عن طريق وضع العلامات المناعية بجسم مضاد محدد وكواشف الكشف المترافقة بالفلوروكروم ، مما يوفر قراءة حساسة لتوزيع الحمض النووي الريبي المستهدف. في النهاية ، تنتج النتائج إشارات فلورية عالية الدقة يتم تحليلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري القياسي من أجل توثيق ميزات التعبير المكاني والزماني للحمض النووي الريبي المستهدف أثناء ذبابة الفاكهة التطور الجنيني.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل اللطخة الشمالية أو R-T-P-C-R هي أنه يمكن للمرء تقييم تعبير الحمض النووي الريبي داخل عينة الأنسجة السليمة. في حين أن هذه الطريقة مخصصة لتحليل خصائص التعبير عن الحمض النووي الريبي في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لتحليل الأجنة في مراحل النمو اللاحقة للأنسجة التي تم تشريحها من اليرقات أو الذباب البالغ. يتمثل أحد الجوانب المهمة في إجراءنا في رفع مستوى عدد العينة الذي يمكننا تحقيقه من خلال إجراء الأسماك في مكان تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يزيد بشكل كبير من إنتاجية النهج.

أعضاء المختبر الذين يوضحون هذا الإجراء مقاومة الأبحاث الجامعية وطلاب الدراسات العليا وزملاء ما بعد الدكتوراه. ابدأ بأقفاص سكانية جيدة التغذية. استبدل الطبق بطبق خميرة عصير التفاح واترك الذباب لمدة ساعة عند 25 درجة مئوية.

ثم استبدل طبق خميرة عصير التفاح لحصاد الأجنة في المراحل المبكرة. احتضان القفص عند 25 درجة مئوية وانتظر حتى يتم الوصول إلى المرحلة النمائية المرغوبة للأجنة أثناء الانتظار في غطاء كيميائي ، واخلط المواد الكيميائية لصنع 37٪ فورمالديهايد في قارورة استنشاق زجاجية. اغلي المحلول حتى يذوب مسحوق PFA تماما.

ثم قم بتبريده إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتصفيته في قارورة تلألؤ جديدة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول تثبيت ثنائي الطور. امزج PBS مع 37٪ فورمالديهايد في قارورة تلألئة ، ثم أضف الهبتان عندما تصبح جاهزا.

احصد الأجنة من طبق عصير التفاح بدرجة حرارة الغرفة وماء الصنبور والكنس الدقيق بفرشاة رسم دقيقة. انقل الأجنة المعلقة إلى سلة واشطفها بماء الصنبور الفاتر. الآن قم بتغطية الأجنة لمدة 90 ثانية عن طريق استحمام السلة في محلول مبيض طازج بنسبة 3٪.

ثم قم بإزالة المبيض بماء الصنبور الفاتر حتى تختفي رائحة التبييض. لجمع الأجنة ، قم بتفكيك سلة التجميع ونقل الأجنة برفق إلى محلول التثبيت ثنائي الطور. باستخدام فرشاة الرسم ، سوف تتراكم الأجنة عند الواجهة بين طبقات PBS والسباع.

الآن أغلق قوارير التلألؤ ، واربطها بخلاط دوامة ورجها لمدة 20 دقيقة على أدنى إعداد. بعد الاهتزاز ، تخلص من معظم مراحل PBS السفلية ومراحل heane العلوية باستخدام ماصة المراعي. ثم استنشق الخليط المتبقي في الماصة وقم بإخراج المرحلة السفلية بعناية دون فقد الأجنة.

قم بإيداع الأجنة في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على محلول ثنائي الطور من 500 ميكرولتر من الهيبتان و 500 ميكرولتر من الميثانول. رج الأنبوب بقوة لمدة 30 إلى 45 ثانية لكسر أغشية الرضفة. بمجرد التشقق ، ستغرق الأجنة في الميثانول.

تخلص من المرحلة العليا والأجنة غير المتشققة وأضف ملليلترا واحدا من الميثانول. الآن هز الأنبوب لفترة وجيزة لمدة خمس ثوان واغسل الأجنة ثلاث مرات بالميثانول. بعد الغسيل ، يمكن تخزين الأجنة لعدة أشهر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

ابدأ بإضافة 500 ميكرولتر من PK إلى كل جنة واحتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز. احرص على إتلاف العينات عن طريق الإفراط في هضمها بالبروتين a k ، أو من خلال التلاعب القذر. أثناء حضانة PK ، اخلطي الأجنة كل دقيقتين عن طريق نفثها بماصة.

بعد 10 دقائق ، ضع الأجنة على الجليد لمدة ساعة. بعد ساعة ، قم بإزالة محلول PK في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأجنة مرتين بالجلايسين في PBT لمدة دقيقتين.

الآن ، قم بإصلاح العينات لمدة 20 دقيقة في مليلتر واحد من 3.7٪ فورمالديهايد في PBT مع الهزاز. اغسل الفورمالديهايد بخمس شطفات في PBT. ثم شطف الأجنة مع ملليلتر واحد من حجم متساوية PBT و HI الحل, واستبدل الخليط مع 0.5 إلى واحد ملليلتر من محلول نقي.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الأجنة لعدة أيام إلى أسابيع عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. في 96 لوحة بئر ، 10 إلى 15 ميكرولترا من الأجنة المستقرة لكل بئر. استخدم طرفا عريضا لتجنب إتلاف الأجنة.

الآن قم بإعداد محلول التهجين المسبق عن طريق غلي 100 ميكرولتر من محلول الضجيج لكل عينة. حسنا لمدة خمس دقائق ، قم بتبريد محلول Pre-Hype على الجليد لمدة خمس دقائق ، ثم أضف 100 ميكرولتر منه إلى كل طبق جيدا يحتوي على عينات الجنين. استرجع مسبار الحمض النووي الريبي المحضر المقدد كميا بواسطة مقياس الطيف الضوئي NanoDrop.

أيضا ، للتحقق من جودة المسبار ، قم بتشغيل ميكرولتر إلى ميكرولتر منه على هلام زراعي. الآن لكل عينة ، قم بتخفيف حوالي 100 نانوجرام من المسبار في 100 ميكرولتر من محلول HI. من الضروري العمل في ظل ظروف خالية من الحمض النووي الريبي.

عند التعامل مع المسبار. سخني المحلول إلى 80 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بتبريده على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل.

يمكن أن تبقى مبردة لعدة ساعات. استرجع اللوحة وقم بإزالة محلول Pre-Hype من الأجنة عن طريق الشفط. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الضجيج مع مسبار الحمض النووي الريبي لكل منها.

قم بتهجين المسبار جيدا عند 56 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة في اليوم التالي. سلسلة من خمسة حلول يتم تسخينها مسبقا عند 56 درجة مئوية. الأول هو حل الضجيج الخالص ، والأخير هو PBT الخالص.

الثلاثة الأخرى هي تخفيف HI إلى PBT. بمجرد تسخينها بسرعة ، اشطف العينات مرة واحدة في محلول الضجيج النقي. بعد ذلك ، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 15 دقيقة ، بدءا من محلول الضجيج الأقل تخفيفا متبوعا بكل من التخفيفات المتتالية.

أخيرا ، اغسل العينات أربع مرات لمدة خمس دقائق في PBT نقي. ثم أحضر العينات إلى درجة حرارة الغرفة. تابع الآن تطبيقات الأجسام المضادة للكشف عن المسبار لتحسين خلط العينات.

خلال هذه الخطوات ، يمكن وضع اللوحة في صندوق صغير قابل للتوصيل بخلاط متحور باستخدام البروتوكول الموصوف ، وتم تحليل قاعدة الزوج الكلاسيكية للجينات في مراحل متميزة من التطور الجنيني. كشف تحليل الأسماك كيف يتم تنقيح التعبير الواسع الأولي في الجزء الأوسط من الجنين في المرحلة الجنينية الرابعة إلى نمط شريطي مجزأ. في مراحل لاحقة ، تم إجراء الأسماك باستخدام العديد من الحفريات وتسمى مضاد للحس ، مجسات الحمض النووي الريبي المهجنة إلى أجنة ذبابة الفاكهة التي يبلغ عمرها من صفر إلى أربع ساعات.

تم الكشف عن المجسات المهجنة عن طريق الحضانات المتسلسلة باستخدام مستضد بيوتينيل وبكتيريا الأجسام المضادة متعطشا في HRP و Ceramide. تم تركيب العينات وتحليلها بواسطة المجهر الفلوري. لوحظت فسيفساء واسعة من نتائج الأسماك في هذه المرحلة من أربعة إلى سبعة أجنة أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام الاحتياطات في خطوات مختلفة مثل حماية مجسات الحمض النووي الريبي وتدهورها من خلال العمل في ظل ظروف خالية من الحمض النووي الريبي واستخدام إمدادات خالية من الحمض النووي الريبي.

بمجرد إتقان هذا الأساسي ، يمكن إضافة خطوات إضافية إلى الطريقة للقيام بتجربة وضع العلامات المتعددة من أجل تصور الحمض النووي الريبي المختلف أو علامات البروتين المحددة في نفس العينة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء الفلورسنت في تهجين C two من أجل توثيق التعبير أو ديناميكيات التوطين تحت الخلوي للحمض النووي الريبي المفضل لديك أثناء ذبابة الفاكهة التطور الجنيني Happy Fishing.